Кривда Р.Г. Ідентифікація особи в судовій медицині на основі ПЛР-аналізу геномної ДНК кісткової тканини

summary

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Під час виконання даної роботи матеріалом для дослідження служили фрагменти діафізів та епіфізів довгих трубчастих кісток (стегнових, великогомілкових, плечових), а також фрагменти ребер від трупів невідомих осіб чоловічої та жіночої статі віком від 20 до 65 років. Матеріал був отриманий із  відділу судово-медичного дослідження трупів, судово-медичного імунологічного та медико-криміналістичного відділень Одеського обласного бюро СМЕ. Усього досліджено 72 кісткові об’єкти.

Підготовку об’єктів до дослідження здійснювали відповідно до рекомен­дацій (Корниенко И. В., Водолажский Д. И., Вейко В. П. и др., 2001).

Використовували такі способи руйнування кісткової тканини і види обладнання. Для руйнування кісткової тканини й отримання кісткового порошку застосовували: напилки з різними за розміром абразивами — дрібним
(бар­хатним), середнім і крупним; пилку з металевим полотном; стоматоло­гіч­ний бор; абразивну речовину (порошок скла); ультразвук.

Для виділення ДНК із компактної та губчастої речовин кісткової тканини використовували чотири протоколи: протокол I (автори Новоселов В. П., Шаронова Д. А., 1999), протокол II (Hoss M., Paabo S., 1993), протокол IIІ (Walsh S. P., Metzger D. A., Higuchi R., 1991), протокол IV (Кривда Г. Ф., Кривда Р. Г., 2005). Вдосконалені нами модифіковані методи виділення ДНК із кісткової тканини  викладені в експериментальному розділі.

Вимірювали концентрацію виділеної ДНК у 1х TNE у присутності інтеркалюючого барвника Hoechst 33258 (10 мг/мл) за допомогою флюориметра Hoefer DyNA Quant ™ 200 (''Hoefer Scientific Instruments'', США).

Виділену ДНК фракціонували методом горизонтального «підводного» електрофорезу в електрофорезній камері ''Hoefer Scientific Instruments'' (США). Електрофорез здійснювали протягом 1 год при напрузі постійного струму 70 В у 1хТВЕ буфері (50 мМ трис-Н₃ВО₃; 2 мМ Na₃ЕДТА; рН 8,0) в 1%-му агарозному гелі з додаванням бромистого етидію до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл.

Для оцінки придатності виділеної ДНК проводили її типування за локусом для визначення статевої належності Amel (Xp22.3–p22.1, Yp11) за допомогою ПЛР. Ампліфікацію ДНК здійснювали на термоциклері "MJ Research PTC-200" (США). Для ампліфікації ДНК використовували набори реагентів виробництва «ТАПОТИЛИ» (Державний науковий центр Російської Федерації «РосНИИгенетика», Росія) і "Promega" (США). Панель мікросателітних локусів: HUMTPOX (хромосома 2p23-pter), HUMD3S1358 (хромосома 3p21.3),  HUMCSF1PO (хромосома 5q33.3-q34), HUMLIPOL (хромосома 8p22), HUMD8S1179 (хромосома 8q24.1-q24.2), HUMTH01 (хромосома 11p15.5), HUMvWFII (хромосома 12p13.3), HUMPAH (хромосома 12q22–q22.4), HUMCYAR04 (хромосома 15q21.1), HUMD16S539 (хромосома 16q24-qter), HUMD19S253 (хромосома 19p13.1), HUMF13B (хромосома 1q31-q32.1), HUMF13A (хромосома 6p24.3-p25/1), HUMFESFPS (хромосома 15q25-qter). Набори реагентів містили 10хПЛР буфери, суміші праймерів, Taq-полімеразу, деіонізовану воду, розчин контрольної ДНК. Їх використовували відповідно до інструкцій виробників. Для ПЛР використовували до 100 нг виділеної ДНК.

Ампліфіковані фрагменти виділеної ДНК розділяли (фракціонували) методом вертикального електрофорезу в скляних пластинах у 10%-х денатуруючих поліакриламідних гелях. Використовували прилад для вертикального електрофорезу моделі "VE-3M" (ТОВ «Хеликон», Москва, Росія). Електрофорез здійснювали протягом 2,5–3,5 год при напрузі постійного струму 550 В у 1хТВЕ буфері (50 мМ трис-Н₃ВО₃; 2 мМ Na₃ЕДТА;
рН 8,0).

Фрагменти ДНК, розділені у поліакриламідних гелях, забарвлювали нітратом срібла згідно з методичними рекомендаціями "DNA Silver Staining System for Technical Manual" ("Promega", США).

Статистичну обробку одержаних даних для визначення основних статистичних показників для характеристики сукупності проводили за рекомендаціями (Рокицкий П. Ф, 1974; Серенко А. Ф., Ермакова В. В., 1984).

Для порівняльного аналізу методів виділення ДНК із компактної речовини фрагмента діафіза — об’єкт № 1 і губчастої речовини ребра — об’єкт № 2 використовували чотири основних протоколи (I, II, III і IV) отримання препаратів ДНК кісткової тканини для ПЛР-типування. Як об’єкти дослідження відбирали «свіжу» кісткову тканину стегнової кістки і ребра, які були взяті через добу після настання смерті. Основним завданням при цьому була розробка модифікацій ключових етапів процедури виділення ДНК для підвищення ефективності проведення експертного дослідження.

При аналізі протоколів для виділення ДНК із кісткової тканини розглядали вплив способів руйнування кісткової тканини, можливості використання мінімальних кількостей досліджуваного матеріалу, визначали оптимальну
кіль­кість кісткового порошку, необхідного для аналізу, вивчали вплив температурно-часових параметрів етапу лізису, підбирали кількість протеолітичного ферменту — протеїнази К, розглядали застосування співосаджувачів для преципітації ДНК і методи очищення розчину виділеної ДНК від до­мішок.

Критеріями ефективності методів виділення ДНК із кісткової тканини служили: кількісний і якісний вихід ДНК (ступінь лізису тканини і клітин, оцінка ступеня деградації ДНК); придатність виділеної ДНК для аналізу методом ПЛР (можливість отримання продуктів ампліфікації на матриці виділеної ДНК); тривалість і трудомісткість процедури екстракції; можливість тривалого зберігання проб виділеної ДНК; відсутність необхідності використання токсичних речовин; зниження ризику контамінації.

Перший етап процедури виділення ДНК із кісткової тканини — одержання кісткового порошку з компактної та губчастої речовин об’єктів дослідження. Ефективність екстракції ДНК залежить від ступеня лізису тканини і клітин. Способом підвищення ефективності лізису є збільшення поверхні контакту кісткових часток із лізуючими агентами за рахунок зменшення їхнього розміру. Кістковий порошок одержували за допомогою різних за розміром абразивів напилків, пилки з металевими полотнами, стоматологічного бора і шляхом розтирання з абразивною речовиною, а також  гомогенізації та руйнування за допомогою ультразвуку.

Виділяли ДНК з 50,0 мг кісткового порошку об’єктів № 1 і № 2, отриманого за допомогою різних способів руйнування кісткової тканини з використанням протоколів I, II, III і IV.

Одержані експериментальні результати виявили, що кількість ДНК, виділеної з губчастої речовини ребра (об’єкт № 2), у середньому втричі більша, ніж кількість ДНК із компактної речовини діафіза стегнової кістки (об’єкт № 1) при використанні будь-якого способу руйнування і протоколу виділення: наприклад, кількість ДНК, виділеної з кісткового порошку об’єкта № 2 при використанні дрібного абразиву, дорівнює (4400,0 ± 21,6) нг, а кількість ДНК, виділеної з об’єкта № 2, — (1400,00 ± 17,32) нг.

Іншим показником ефективності способу руйнування кісткової тканини є якість виділеної ДНК. Якісно виділена ДНК у гелі візуалізується у вигляді високомолекулярної фракції (близько 10 000 п. н.) без «шлейфа» і додаткових фрагментів. Дані попередньої оцінки якості виділеної ДНК із кісткового порошку об’єкта № 1, одержаного за допомогою різних способів руйнування кісткової тканини при використанні протоколу I, відображені на рис. 1.

Рис. 1. Електрофореграма виділеної ДНК (об’єкт № 1, протокол І): М — маркер молекулярної маси pGEM; К — контрольна високомолекулярна ДНК, запропонована фірмою "Promega" (США); 1 — дрібний абразив; 2 — стоматологічний бор; 3 — розтирання і гомогенізація з абразивом; 4 — гомогенізація і руйнування за допомогою ультразвуку

Виділена ДНК має молекулярну масу більше 10 000 п. н., тобто високо­­-молекулярною.

Основним показником ефективності способу руйнування кісткової тканини є придатність виділеної ДНК для типування методом ПЛР. Для оцінки придатності (якості) виділеної ДНК проводили її ПЛР-типування за локусом Amel.

Отримані дані дозволяють визначити спосіб руйнування кісткової тканини шляхом розтирання кісткового порошку з абразивом як найефективніший, що дає можливість виділити з високою концентрацією ДНК, придатну для ПЛР-типування, при використанні будь-якого з аналізованих протоколів виділення ДНК.