ГИЛЯЗОВА Лилия Булатовна СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕЧЕНОЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ У КРЫС ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ

summary

работа изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения собственных данных, выводов и списка литературы, включающего 182 источника отечественных (133) и зарубежных (49) авторов. Диссертация  содержит 16 таблиц, 9 графиков, 39 фотографий микропрепаратов.

         Настоящая работа является частью комплексных исследований о воздействии геморрагического инсульта на органы иммунной системы и лимфоидные образования организма.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования служили печеночные лимфатические узлы, располагающиеся в гепато-дуоденальной связке от 63 крыс-самцов линии Вистар весом 250-300г в возрасте 4-6 месяцев. Крысы содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде.

Объектом исследования явились крысы-самцы линии Вистар, устойчивые к стрессу. Оценка устойчивости к стрессу определялась  по их поведению в тесте «открытое поле» с помощью специальной компьютерной программы (Коплик Е. В., 2002).

При работе с животными учитывались положения приказа Минвуза СССР № 742 от 13.11.84 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» и № 48 от 23.01.85 г.

Животные были разделены на 3 группы. В 1-ю группу вошли  интактные крысы, во 2-ю - крысы, которым проводилась только трепанация черепа, в 3-ю - животные с экспериментальным геморрагическим инсультом.

С целью создания инсульта у крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг внутримышечно), производилась трепанация черепа и затем при помощи специального устройства (мандрен-нож) и стереотаксиса деструкция мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения 50-60 мкл аутокрови, взятой из бедренной вены непосредственно перед ее введением в головной мозг. Введение крови в левое хвостатое ядро проводили в два этапа: в течение 7 минут вводили 20 мкл крови, затем через 10 минут еще - 40 мкл (в течение 10 минут). После этого через 5 минут канюля медленно извлекалась. Отверстие в черепе заделывали стоматологическим цементом, кожу ушивали. Такая методика позволяла создавать  приблизительно одинаковый размер гематом у всех подопытных животных и ограничивать выход крови по каналу вдоль иглы. Летальных исходов не было. Общий объем гематомы в перерасчете на человека составлял приблизительно 50-60 мкл, и по локализации соответствовал кровоизлияниям, возникающим в клинических условиях при разрыве лентикулостриарных артерий. В качестве контроля использованы крысы, которым была проведена трепанация черепа. Они проходили все стадии создания геморрагического инсульта без введения крови через иглу.

Воспроизведенная модель геморрагического инсульта максимально приближается к клиническим проявлениям острого цереброваскулярного заболевания человека, а экспериментальные животные вполне пригодны для изучения у них процессов нарушения высшей нервной деятельности. Наблюдения проводили в течение 7 суток после операции. Регистрировали особенности поведения и состояния животных на 1, 3, 7 сутки после операции.

Материалом для исследования послужили печеночные лимфатические узлы крыс-самцов линии Вистар, расположенные в печеночно-двенадцатиперстной связке. Для светооптического изучения лимфатические узлы фиксировали в 10% растворе формалина,  с последующим обезвоживанием в этаноле возрастающей концентрации и заливкой в парафин-целлоидин (Меркулов Г.А., 1961). Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.  Для морфологической оценки препарата органа (соотношения коркового и мозгового вещества)  гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по ван Гизон.  Для дифференцировки лимфоидных клеток использовали окраску срезов азур-II-эозином. Для выявления малодифференцированных клеток (бластов и больших лимфоцитов) и  плазматических клеток   применили окраску метиловым зеленым – пиронином по Браше.         

 При изучении морфо-функциональных зон печеночных лимфатических узлов использовали микроскоп МБИ-3 при увеличении объектива – 90 под масляной иммерсией  и с 25-узловой сеткой (Стефанова С.Б., 1985) в окуляре (х10). Оценка  структурной организации органа проведена под микроскопом МБИ-3  при увеличении объектива х10 и  х40 и окуляра  х10.  В каждой морфологической структуре печеночного лимфатического узла  подсчет клеток  проводили на условной единице площади гистологического среза 880 мкм²  в  5 полях зрения при случайном смещении окулярной сетки.

Изучение цитоархитектоники морфологических зон печеночных лимфатических узлов проводили в следующих структурных компонентах органа: в центрах размножения  и  мантии лимфоидных узелков, в лимфоидных узелках без центров размножения, в паракортикальной зоне, мякотных тяжах, воротном и мозговых синусах.

         На гистологических срезах в каждой  функциональной зоне печеночного лимфатического узла  крыс проведен качественный  и количественный анализ клеточного состава. Проанализировано 14 видов  клеток: бласты, большие, средние  и малые лимфоциты, незрелые и зрелые плазматические клетки, зрелые и незрелые формы нейтрофилов и эозинофилов, клетки с картинами митоза, ретикулярные клетки, макрофаги и деструктивно измененные и разрушенные клетки.  При определении класса лимфоцитов использовали классификацию Сапина М.Р. (1988).

Методом стереометрии  и методом наложения точечных морфометрических сеток (Стефанов С.Б., 1985) определяли объемную плотность структурных зон лимфатических узлов. При наложении сетки считали количество точек, выпадающих на структурную зону лимфатического узла. Определяли площади мантии и центров размножения лимфоидных узелков, лимфоидных узелков  без центров размножения, паракортикальной зоны, мякотных тяжей, мозговых синусов, краевого синуса, толщину капсулы. Рассчитывали соотношение площади коркового вещества к площади мозгового (корково-мозговой индекс – к/м) в каждой экспериментальной группе, по результатам которого определяли структурно-функциональный тип лимфатического узла (Бородин Ю.И., 1969).

         Полученный цифровой материал подвергался статистической обработке. Получены показатели среднеарифметических  значений  абсолютных и относительных величин (X) и их ошибки (sX).  Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента (Плотский Н.А, 1970).  Различия считались достоверными при p≤0,05. Статистическая обработка цифровых данных и изготовление демонстрационных материалов (таблицы, графики)  осуществлялись с помощью программ Microsoft Excel 2003.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Принимая во внимание социальное и биомедицинское значение геморрагического инсульта, мы провели экспериментальное исследование морфофункционального состояния регионарных печеночных лимфатических узлов крыс  интактной группы, крыс Вистар  на 1-е, 3-е, 7-е сутки после трепанации черепа и  острый период после геморрагического инсульта (на 1-е, 3-е, 7-е сутки).

Результаты исследования показали, что на разных этапах эксперимента после геморрагического инсульта  у крыс отмечаются  различные по характеру изменения структуры и цитоархитектоники функциональных  зон печеночных лимфатических узлов.

Результаты  нашего исследования показали  наличие перестройки  состава клеток лимфоидного ряда во всех структурных зонах печеночных лимфатических  узлов, которая прослеживается на фоне глубоких микроциркуляторных нарушений в сосудистом русле при геморрагическом инсульте, выходящие на первый план. Нарушение гемодинамики выражается в склеивании эритроцитов, образовании «монетных» столбиков и конгломератов, сепарации плазмы, прилипании эритроцитов к стенке сосудов, приводящих, в итоге, к застойным явлениям в венозном и артериальном русле.  Похожую картину наблюдала при воздействии гипокинезии на лимфатические узлы у обезьян  Ерофеева Л.М.(2005, 2006). Отмечается пристеночное стояние лейкоцитов.

В результате застойных явлений в микроциркуляторном русле в паренхиме коркового и мозгового вещества печеночных лимфатических узлов отмечаются кровоизлияния уже на  1-е сутки после геморрагического инсульта. Свежих кровоизлияний на 3-е и 7-е сутки не выявлено.

Площадь печеночных лимфатических узлов у интактных крыс составляет 6,13±0,55мм². По своей структурно-региональной специализации печеночные лимфатические узлы интактных крыс приближаются  по классификации Ю.И.Бородина (1969) к узлам промежуточного типа (корково-мозговой индекс равен 1,07±0,05). Площадь коркового вещества  составляет 47,47±1,26%.  На входящие в его состав узелки без центров размножения и с центрами размножения, приходится 0,08±0,01мм²  и 0,79±0,03мм². Площадь центров размножения лимфоидных узелков составляет 0,16±0,01мм², а площадь их мантии  - 0,62±0,03мм². Абсолютная площадь паракортикальной зоны (Т-зоны) составляет 2,05±0,07мм² (или 33,35±1,2%, соответственно).  Площадь мозгового вещества составляет 44,17±1,27%. При этом на площадь мякотных тяжей приходится 1,46±0,07мм², а мозговых синусов - 1,31±0,03 мм². Площадь краевого синуса составляет 0,23±0,02 мм², толщина капсулы  - 21,83±0,73 мкм.

На 1-е сутки после геморрагического инсульта общая площадь печеночных лимфатических узлов увеличивается в 1,4 раза (до 8,03±0,25мм²) по сравнению с интактной группой, тогда как на 3-е сутки  - остается на уровне значений 1-х суток. На 7-е сутки после геморрагического инсульта площадь печеночных лимфатических узлов уменьшается  в 1,2 раза (достигая  7,27±0,26мм²) по сравнению с 3-ми сутками. При трепанации черепа общая площадь печеночных лимфатических узлов увеличивается незначительно на 1-е, 3-и и 7-е сутки, по сравнению с интактной группой животных.

Площадь центров размножения лимфоидных узелков  на 1-е сутки после геморрагического инсульта увеличивается в 1,75 раза (до 0,28±0,01мм²).  На 3-и сутки   площадь продолжает увеличиваться в 1,6 раз (0,45±0,02мм²)  по сравнению с 1-ми сутками, что в 2,8 раза больше интактных значений. На седьмые сутки после геморрагического инсульта площадь центров размножения лимфоидных узелков начинает уменьшаться до 0,39±0,02мм², что в 2,43 раза больше интактных значений. При трепанации черепа площадь центров размножения лимфоидных узелков на 1-е и 3-и сутки увеличивается в 2,1 раза, а на 7-е сутки значительно уменьшается, в 1,5 раза, по сравнению с 3-ми сутками.

Площадь мантии лимфоидных узелков на 1-е сутки после геморрагического инсульта увеличивается в 2 раза (до 1,25±0,06мм²). На 3-е сутки эксперимента площадь мантии продолжает увеличивается в 1,24 раза, по сравнению с 1-ми сутками, что больше интактных значений 2,5 раза. На 7-е сутки после геморрагического инсульта  площадь мантии лимфоидных узелков уменьшается в 1,2 раза, по сравнению с 3-ми сутками, но не  достигает интактных значений.

При трепанации черепа отмечается процесс увеличения площади мантии в 1,4 раза на 1-е сутки, в 1,8 раза - на 3-е сутки и в 1,9 раза – на 7-е сутки по сравнению с интактными крысами.

Увеличение размеров лимфоидных узелков с центрами размножения как за счет центром размножения, так и за счет мантии лимфоидных узелков, может свидетельствовать  об активации иммунного ответа по гуморальному типу (Петров Р.В., 1987).

Абсолютная площадь паракортикальной зоны в 1 сутки эксперимента увеличивается в 1,2 раза по сравнению с интактной группой (2,45±0,04мм²). Площадь Т-зоны  на 3-и сутки уменьшается в 1,2 раза (1,98±0,04мм²) и остается на этом же уровне на 7-е сутки по сравнению с 1-ми суткам после геморрагического инсульта, но недостоверно ниже интактных значений. При трепанации черепа площадь паракортикальной зоны незначительно увеличивается на 1-е сутки, затем незначительно уменьшается на 3-и сутки и становится меньше интактных значений на 7-е сутки в 1,15 раз, что может говорить о миграции Т-клеток из этой зоны.

Площадь мякотных тяжей  на 1 сутки после геморрагического инсульта незначительно увеличивается (до 1,55±0,06мм²) и практически остается такой же  на 3-и сутки (до 1,58±0,05мм²). На 7-е сутки происходит некоторое уменьшение площади мякотных тяжей до  1,39±0,06мм², что недостоверно меньше интактных значений. Это указывает на активацию гуморального иммунитета на 1-е и 3-и сутки после геморрагического инсульта и незначительное угнетение его на 7-е сутки. При трепанации черепа площадь мякотных тяжах уменьшается в 1,24 раза, по сравнению с интактными значениями, на 3-и сутки – незначительно увеличивается, а на 7-е сутки – вновь уменьшается в 1,3 раза по сравнению с интактными крысами, что говорит об угнетении гуморального иммунитета на 1-е, 3-и и 7-е сутки после трепанации черепа.

 Площадь  мозговых синусов  на первые сутки после геморрагического инсульта увеличивается в 1,46 раза (до 1,82±0,05мм²) по сравнению с интактной группой животных. На 3-и сутки после эксперимента площадь мозговых синусов остается практически на уровне значений 1-х суток и уменьшается в 1,2 раза на 7-е сутки, по сравнению с 3-ми сутками, но не  достигает уровня интактных значений. Это указывает на активацию дренажной функции лимфатических узлов на протяжении 7-ми суток. Увеличение площади мозговых синусов паховых лимфатических узлов  на 1-е и 3-и сутки отмечают также Анцырова Ю.С. (2004) после постишемической реперфузии и Тихонов И.В.(2008) -  при венозном застоев малом тазу на 3-и и 7-е  сутки в подвздошных лимфатических узлах, Аль-Хусеин Э.М.(2005) – в брыжеечных лимфатических узлах при дегидратации.

Изменения клеточного состава печеночных лимфатических узлов при экспериментальном геморрагическом инсульте.

Исследование печеночных лимфатических узлов позволило выявить структурно-клеточные преобразования в них.

В центрах размножения лимфоидных узелков плотность распределения клеток на стандартную площадь среза 880 мкм² на 1-е сутки после геморрагического инсульта увеличивается в 1,4 раза (до 49,47 клетки) по сравнению с интактной группой животных (табл.1, рис.1).  На 3-е сутки эксперимента плотность клеток на стандартной площади среза незначительно уменьшается (р>0,05). На 7-е сутки после геморрагического инсульта продолжается незначительное уменьшение плотности клеток на стандартной площади среза (р>0,05), однако это значение в  1,24 раза больше, чем у интактных животных.

Содержание малодифференцированных клеток (бластов и больших лимфоцитов) в центрах размножения лимфоидных узелков печеночных лимфатических узлов на 1-е сутки после геморрагического инсульта  увеличивается в 1,8 раза (р=0,05) (Рис.2), по сравнению с интактными животными. На 3-и сутки эксперимента количество малодифференцированных клеток увеличивается незначительно (р>0,05) по сравнению с 1-ми сутками. На 7-е отмечается резкое уменьшение числа малодифференцированных клеток в 4,2 раза по сравнению с 3-ми сутками, что в 2,1 раза меньше чем у интактных крыс. Это говорит о замедлении лимфопоэза на 7 сутки после геморрагического инсульта.