Кичигина Оксана Николаевна Клинико-морфологические и иммуногистохимические особенности различных вариантов саркоидоза легких : Кічігіна Оксана Миколаївна Клініко-морфологічні та імуногістохімічні особливості різних варіантів саркоидоза легких

summary

Работа выполнена на архивном материале открытых биопсий легких, полученном от  50 больных саркоидозом. Больные находились на лечении в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней  им. Тареева и в клинике факультетской хирургии им. Н.Н. Бурденко ПМГМУ им. И.М. Сеченова с 1998 по 2006 гг. Всем больным были проведены лабораторно-инструментальные (общий и биохимический анализ крови, спирометрия, общий и биохимический анализ мочи), а также выполнены рентгенологические исследования (рентгенография и компьютерная томография органов грудной клетки, для каждого больного вычислен легочно-торакальный индекс в целях выявления легочной гипертензии [RU 2269931 C1. Осипенко В.И. и др. Способ компьютерной диагностики степени легочной гипертензии. 2006.02.20], выполнена открытая биопсия легких. В качестве морфологической контрольной группы мы использовали 10 биопсий нормальных  тканей легких, взятых от больных с предполагаемым клиническим диагнозом саркоидоза легких, который впоследствии не был подтвержден. Среди больных преобладали мужчины (30 человек), женщин было 20 человек, возраст больных колебался от 30 до 75 лет. В контрольной группе мужчин было 4, женщин – 6, возраст их колебался от 40 до 75 лет. Исследовано 400 образцов ткани легких — с каждого блока делалось 8 срезов. Изучались макропрепараты удаленных легких, а также серийные парафиновые  срезы  толщиной 5 мкм  с использованием окраски гематоксилина и эозина.

Иммуногистохимические  реакции проводились на  серийных парафиновых  срезах толщиной 4 мкм на стеклах c адгезивным силанизированным покрытием. Демаскировка антигенов  проводилась в микроволновой печи с использованием цитратного буфера (рН 6,0) и при мощности 600 Вт. В  качестве первичных антител применялись моноклональные и поликлональные антитела к ApoCas (ready to use; NOVOCASTRA, Великобритания), PCNA (ready to use; NOVOCASTRA, Великобритания), a-SMA (ready to use; NOVOCASTRA, Великобритания),  ММР-1,2,9 (ready to use; LAB VISION, США), TIMP-1(ready to use; LAB VISION, США), В качестве вторичных антител – смесь противомышиных и противокроличьих антител со стрептовидин-биотиновым комплексом (SBK KIT DAKO, Дания). Ставили положительные и отрицательные контроли.

Результаты иммуногистохимических реакций оценивались в процентах по количеству клеток с позитивным окрашиванием. Учитывалась локализация продукта реакции – в гранулеме и в окружающей легочной ткани, а также его интенсивность. Оценка экспрессии  Apo-Cas осуществлялась путем подсчета процента окрашенных ядер на 300 клеток.

При статистической обработке были использованы непараметрические методы, так же, как и для анализа переменных, относящихся к порядковой шкале. Для сравнения средних величин применялись непараметрические тесты: тест Уайта для малых выборок (обработка результатов иммуногистохимического  анализа с малыми выборками была проведена вручную при помощи калькулятора и таблиц значений F); U тест по методу Манна-Уитни при сравнении 2-х независимых выборок. При оценке достоверности выявленных различий между средними значениями выборок и достоверности выявленной корреляции рассчитывалась вероятность ошибки P. Критический уровень значимости различий между группами был принят равным р=0,05. Во всех случаях использовались двусторонние статистические критерии. В результате сопоставления клинико-лабораторных, лучевых и морфологических данных выделены 3 группы больных:   1 группа – с внутригрудной лимфаденопатией и с невыраженным патологическим процессом в легочной ткани (18 пациентов - 36%), 2 группа – с незначительной лимфаденопатией и преимущественной локализацией гранулематозных комплексов периваскулярно, перибронхиально, вдоль междолевой плевры и субплеврально (25 пациентов - 50%), 3 группа – с крупными гранулематозными очагами в интерстиции, перибронхиально, с различными фиброзными изменениями (от средне-выраженных до кистозно-буллезной трансформации (7 пациентов -14%), страдавших  нередко поражением других органов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микроскопическая характеристика

При микроскопическом исследовании легких пациентов с саркоидозом выявлено ремоделирование легочной ткани за счет сочетания гранулематозного воспаления и слабо выраженного альвеолита и бронхиолита.

У пациентов 1 группы гранулемы в легочной ткани преимущественно локализовались по ходу лимфатических коллекторов в периваскулярной, перибронхиальной ткани, что практически не сопровождалось развитием склеротических изменений. Характерной особенностью саркоидных гранулем являлось отсутствие казеозного некроза в центре. Примерно в половине случаев в гигантских многоядерных клетках можно было обнаружить характерные цитоплазматические включения – звездчатые или астероидные тельца. Обращал на себя внимание «штампованный» вид гранулем за счет периферически расположенных фибробластических элементов и коллагена. Нами установлено, что 80% фибробластических элементов по периферии гранулем экспрессируют гладкомышечный актин (а-SMA), что подтверждает их миофибробластическую природу.

У пациентов 2 группы при микроскопическом исследовании выявлено ремоделирование легочной ткани за счет сочетания активного гранулематозного воспаления, альвеолита и бронхиолита, выраженных в разной степени, а также умеренного интерстициального фиброза. Микроскопические изменения, в основном, представляли собой образование гранулем в легочной ткани в интерстиции, по ходу лимфатических коллекторов в периваскулярной, перибронхиальной ткани, субплеврально и в плевре, что сопровождалось развитием склеротических изменений, от слабовыраженных до умеренных. Иногда процесс сопровождался развитием хронического экссудативно-продуктивного альвеолита с мелкими очаговыми пролифератами а-SMA-положительных миофибробластов в области бронхиоло-альвеолярной переходной зоны. Микроскопические особенности альвеолита при саркоидозе  характеризовались  повреждением альвеолярных структур с развитием лимфогистиоцитарной клеточной инфильтрации альвеолярного интерстиция, выраженной в разной степени. Иногда лимфогистиоцитарная инфильтрация сопровождалась наличием единичных полиморфно-ядерных лейкоцитов с дисрегенераторными изменениями в паренхиме и в строме респираторных отделов легкого. При этом альвеолярный и бронхиолярный эпителий инфильтрирован клетками воспалительного экссудата и  инфильтрата, как со стороны просвета, так и со стороны интерстиция альвеол и бронхиол. Обнаружены немногочисленные миофибробластические фокусы, распложенные преимущественно в области бронхиоло-альвеолярной переходной зоны и построенных из пролиферирующих  а-SMA-положительных миофибробластов. Иногда в ткани легкого выявлялись  кальцифицированные пластинчатые тельца Шауманна, содержащие соли кальция и железа.

При локализации гранулем по ходу плевральных лимфатических сосудов отмечалось незначительное утолщение и фиброз плевры.

У пациентов 3 группы при микроскопическом исследовании выявлено ремоделирование легочной ткани за счет сочетания гранулематозного воспаления, альвеолита и бронхиолита, выраженных в разной степени, а также  интерстициального фиброза, уровень которого составлял от умеренного до сильного.

Гранулемы в легочной ткани локализовались в интерстиции, единично встречались по ходу лимфатических коллекторов в периваскулярной, перибронхиальной ткани, субплеврально и в плевре, что сопровождалось развитием склеротических изменений, выраженных в разной степени.  Часть гранулем затрагивала бронхиоло-альвеолярную переходную зону.

Интерстициальный фиброз носил в основном очаговый характер, эпицентром которого являлись  конгломераты из гранулем, от которых в легочный интерстиций отходили фиброзные тяжи. При микроскопическом исследовании выявлены альвеолярно-капиллярный блок, панацинарная эмфизема, бронхиолоэктазы, образование псевдожелезистых структур, склероз стенок бронхиол и сосудов, образование кистевидных расширений альвеол и фиброзных полей на месте разрушенной ткани.

При исследовании на малом увеличении видны фибротические зоны плотного коллагена с типичным субплевральным и парасептальным расположением, а также демаркационная линия между нормальной тканью и тканью сотового легкого с минимальными признаками хронического воспаления. На большом увеличении обнаружены крупные очаговые пролифераты SMA-положительных миофибробластов, окруженных коллагеновыми волокнами, преимущественно в области бронхиоло-альвеолярной переходной зоны (миофибробластические фокусы). Количество SMA-положительных миофибробластических фокусов возрастало по мере развития фиброза легких. Кистозные структуры сотового легкого выстланы аденоматозно-гиперплазированным альвеолярным эпителием.  Альвеолоциты 1-го типа замещаются гиперплазированными альвеолоцитами 2-го типа с развитием очаговой аденоматозной гиперплазии. При атипической аденоматозной гиперплазии отмечается увеличение размеров клеток, появление признаков клеточного и ядерного полиморфизма. При этом тяжелая патология развивается в области аэрогематического барьера, которая проявляется клинически в виде прогрессирующей дыхательной недостаточности, нарастанием легочной гипертензии. Аэрогематический барьер блокируется и перестает функционировать, как за счет выраженного фиброза интерстиция альвеолярных перегородок, так и за счет дисрегенераторных изменений в эпителиальной выстилке.

После морфологического сопоставления биоптатов с группой контроля было отмечено, что главной морфологической особенностью саркоидоза является содержание умеренного количества клеток в просвете альвеол и невыраженный интерстициальный фиброз. Альвеолярные перегородки утолщены незначительно, инфильтрированы лимфоцитами, иногда эозинофилами, однако фиброз, как правило, выражен слабо. На поздней стадии помимо альвеолярных макрофагов в просвете альвеол присутствуют и десквамированные клетки гиперплазированного альвеолярного эпителия нередко с дисрегенераторными изменениями в виде плоскоклеточной метаплазии.

Таким образом, результаты нашего исследования подтверждают, что морфологическим маркером ремоделирования легочной ткани при саркоидозе являются образование саркоидных гранулем преимущественно в интерстиции по ходу  лимфатических коллекторов в паренхиме легкого и в плевре с развитием умеренного перифокального склероза с участием миофибробластов и фибробластов, располагающихся в области бронхиоло-альвеолярной переходной зоны, а также возникновение альвеолита и интерстициального фиброза, выраженного в разной степени. Подробное изучение механизма ремоделирования легочной ткани при саркоидозе легких было проведено с помощью рентгенологических и иммуногистохимических методов.

Ремоделирование легочной ткани по результатам рентгенологических методов исследования

При компьютерно-томографическом методе исследования больных 1 группы выявлено симметричное увеличение лимфоузлов всех групп центрального средостения и корней легких. Стоит отметить, что при саркоидозе характерной особенностью явилась многочисленность увеличенных узлов в каждой анатомической группе с формированием крупных конгломератов, преимущественно в бифуркационной группе (85%).

При проведении экспираторной КТВР в 40% случаев обнаружен симптом «воздушной ловушки». В клинически активную фазу процесса наряду с лимфаденопатией выявляли ограниченные изменения в легочной паренхиме в виде мелкоочаговой перилимфатической диссеминации (47%), единичных крупных очагов (20%), консолидации (10%) и симптома «матового стекла» (40%). Лёгочно-торакальный индекс в 1 группе в среднем составил  9,0±1,3, что соответствует норме, а также не отличалось от контрольной группы.

Стоит отметить, что помимо поражения лимфатических узлов присутствовали невыраженные субплевральные фиброзные изменения.

Изучение 2 группы с преимущественной локализацией гранулематозных комплексов периваскулярно, перибронхиально, вдоль междолевой плевры и субплеврально, выявленной у 25 больных (50%), показало, что характерными особенностями были двусторонняя перилимфатическая мелкоочаговая диссеминация (90%) в сочетании с неравномерным «четкообразным» утолщением междольковых перегородок, перибронхиального и периваскулярного интерстиция. Наиболее типично было распределение очагов вдоль листков междолевой плевры (60%).

Очаговые изменения в большинстве случаев занимали от 40% до 75% объема легочной паренхиме в каждой доле. Измерение легочно-торакального индекса показало, что легочная артериальная гипертензия невыраженная. Но, тем не менее, находится на верхней границе нормы, а в 5 случаях (20%) достигала умеренной (легкой) степени — 8,3±1,1.

Одним из важных КТ-проявлением саркоидоза легких является симптом «матового стекла» (60%). У части пациентов множественные мелкие очаги формировали ограниченные зоны уплотнения легочной паренхимы по типу «матового стекла» неправильной формы, с нечеткими контурами.

В активной фазе саркоидоза очагово-интерстициальная диссеминация сопровождалось увеличением всех групп лимфоузлов центрального средостения  (95%).

В 3 группе больных, у которых преобладали крупные гранулематозные очаги в интерстиции (80%), перибронхиально, с различными фиброзными изменениями течение заболевания было преимущественно хроническое рецидивирующее. На компьютерных томограммах изменения проявлялись симптомом перибронхиальной консолидации. Перибронхиальные инфильтраты сочетались с очаговой диссеминацией и внутригрудной аденопатией. Стоит отметить, что данный вариант характеризовался хроническим неблагоприятным рецидивирующим течением. КТ - исследования в динамике показали, что затихание или обострение процесса проявлялись лишь уменьшением или нарастанием участков перибронхиальной консолидации, диффузных линейных и ретикулярных уплотнений. Остаточные изменения отличались нарушением архитектоники легочной ткани, формированием в 2-х случаях (38%) кистозно-буллезной трансформации в виде «сотового легкого», развития буллезной эмфиземы. Легочное артериальное давление у данных больных была выше нормы и составляла в среднем по легочно-торакальному индексу 5,0+-1,2.

Таким образом, признаками ремоделирования легочного интерстиция по результатам мультиспиральной компьютерной томографии являются симптом диссеминации (образование саркоидозных гранулем в ткани легких), симптом «матового стекла» (развитие лимфогистиоцитарного альвеолита), симптом «воздушной ловушки» (бронхиолит), перибронхиальая консолидация, уплотнение листков междолевой и паракостальной плевры, развитие диффузных линейных и ретикулярных уплотнений.

Ремоделирование легочной ткани по результатам иммуногистохимических методов исследования

Проведенное нами иммуногистохимическое исследование позволило установить особенности ремоделирования легочного интерстиция и дисрегенераторных изменений эпителия при саркоидозе легких. Ниже представлены особенности экспрессии каждого изученного маркера в легочной ткани у разных групп больных с саркоидозом:

В 1 группе больных в среднем уровень экспрессии PCNA в клетках саркоидной гранулемы составил в среднем 10%. Наиболее высокие показатели пролиферативной активности обнаружены в миофибробластах и эпителиоидных клетках гранулемы  Экспрессия PCNA в легочной ткани у больных на уровне бронхиол и альвеол не отличается от таковой в контрольной нормальной легочной ткани.

У пациентов 2 группы средний уровень экспрессии PCNA в клетках саркоидной гранулемы, а именно в миофибробластах и эпителиоидных клетках, составил 18%. В окружающей легочной ткани экспрессия PCNA находился на низком уровне.

Эксперссия PCNA в 3 группе нарастала, порой достигая 23%± 9,92%; P<0,05, в основном за счет миофибробластов и эпителиоидных клеток. В местах, где саркоидные гранулемы локализовались в БАПЗ экспрессия PCNA была обнаружена в эпителиальных клетках аденоматозных структур и макрофагах, составляя 44%± 6,92%; P<0,05. В остальных клетках переходной зоны (в фибробластах, миофибробластах и эндотелии очагов ангиогенеза). PCNA присутствует  на умеренном уровне. Таким образом, полученные результаты показали, что при саркоидозе у пациентов 3 группы обнаруживается наиболее выраженная пролиферация эпителия и клеток стромы (фибробластов,  миофибробластов, макрофагов, эндотелиоцитов) в области БАПЗ. Очаги регенерации альвеолоцитов могут выступать в качестве сигналов к вовлечению мезенхимальных клеток с помощью  различных факторов роста, продуцируемых гиперплазированными альвеолоцитами 2 типа. Большинство этих факторов роста активируют тирозинкиназный путь пролиферации фибробластов, миофибробластов и продукции компонентов межклеточного пространства. Взаимодействие между этими  клетками может быть ключевым звеном патогенеза прогрессирующего легочного фиброза при тяжелом течении саркоидоза легких.

Аро-CAS.  Продукт реакции локализовался в ядрах клеток. Экспрессия маркера у пациентов 1 группы была самая низкая, составляя при этом 1,5%, в основном за счет макрофагов. В окружающей легочной ткани экспрессия практически отсутствовала.

Экспрессия Аро-CAS макрофагами и лимфоцитами в клетках саркоидной гранулемы у пациентов 2 группы составляла в среднем 2,5%. Окружающая легочная ткань была интактна.

В 3 группе больных с тяжелым течением саркоидоза экспрессия аро-CAS была наиболее высокой, достигая 4%. Также стоит отметить, что Apo-CAS обнаруживается в ядрах гиперплазированных клеток БАПЗ: в эпителии аденоматозных структур (16,91% ± 0,95%; P<0,05) и макрофагах (5,59% ± 0,44%; P<0,05). Уровень Apo-CAS в других локализациях респираторного отдела легочной ткани не отличается от контрольной нормы.

По нашим данным повышенная готовность альвеолярного и бронхиолярного эпителия к апоптозу отмечается в переходной зоне. В то же время признака апоптоза a-SMA-положительных миофибробластов отсутствует.

Альвеолярная микросреда при тяжелом течении саркоидоза характеризуется постоянно высокой концентрацией фиброгенных цитокинов, факторов роста, свободных кислородных радикалов и других реактивных биомолекул, вызывающих деструкцию базальной мембраны и ремоделирование ВКМ. Нарушенные клеточные сигналы микросреды могут обусловливать персистенцию миофибробластов при прогрессирующем фиброзе.

ММР и ТIМР-1. Изучение экспрессии металлопротеиназ в клетках саркоидной гранулемы, выявлено, что в 1 группе продукция матриксных металлопротеиназ ММР-1, ММР-2, ММР-9 была невысокая, в основном за счет макрофагов и миофибробластов гранулем, экспрессия ТIМР-1 была на низком уровне (рис.1а-б). Во 2 группе наиболее активными в плане продукции ММР-1, ММР-2, ММР-9 оказались макрофаги гранулемы. В них преобладала ММР-2 , а также  ММР-9, ТIМР-1 (рис.2а-б).

В миофибробластах отмечался средний уровень экспрессии  ММР-2 , умеренная - ММР-9, а также низкая -  ММР-1 и  ТIМР-1.Наименее активными оказались лимфоциты, в которых отмечена низкая экспрессия ММРs и ТIМР-1.

В 3 группе макрофаги и миофибробласты экспрессировали высокие уровни ММР-1, ММР-2, ММР-9 и ТIМР-1 (рис.3а-б).