БАНТЫШ БОРИС БОРИСОВИЧ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭПИТЕЛИАЛЬНО-СТРОМАЛЬНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ ПРИ ЖЕЛЕЗИСТОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ : Бантиш БОРИС БОРИСОВИЧ Иммуноморфологичні ОСОБЛИВОСТІ епітеліальних-СТРОМАЛЬНИХ ВЗАЄМОВІДНОСИН ПРИ залізистих ГІПЕРПЛАЗІЇ ЕНДОМЕТРІЯ

summary

Исследование выполнено на материале соскобов эндометрия (60 больных) и удаленных маток (41) от 101 женщины в возрасте от 27 до 72 лет с верифицированными диагнозами: простая ГЭ, комплексная ГЭ, комплексная атипическая ГЭ, ЭИН, ЭА. Критериями исключения служили проведённая ранее гормональная терапия, а также эндометриальные карциномы П типа. В качестве группы сравнения использовали соскобы от женщин без патологии эндометрия поздней стадии фазы пролиферации, проходивших обследование перед установкой внутриматочной. Разделение на группы проведено по морфологическим характеристикам гистологического материала согласно Классификация опухолей тела и шейки матки (ВОЗ, Lyon, 2003). Диагноз ЭИН устанавливали на основании морфологических характеристик, разработанных G. Mutter, Endometrial Collaborative Group.

  Для получения морфометрических данных использовали программу «Axio Images As». В качестве объекта морфометрического анализа структурных изменений в эндометрии выбрана структурная единица эндометрия (СЕЭ) по Н.И. Кондрикову. Вычислялась площадь компонентов СЕЭ: эпителия, просвета желёзы, площадь всей железы, и площадь окружающей эндометриальную желёзу соединительнотканной стромы.    

  Было проведено иммуногистохимическое выявление антигенов в парафиновых срезах иммунопероксидазным методом двойных антител с стрептовидин-биотиновым комплексом по общепринятой методике. В качестве первичных антител были использованы моноклональные антитела к антигену Ki-67 (Dako) и PTEN (Dako). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика (Dako LSAB + KIT, PEROXIDASE). Рабочая концентрация составила 1:100 и 1:200. Ставили позитивные и негативные контрольные реакции.

  Для оценки эпителиально-стромальных взаимоотношений использовали эпителиально-стромальный индекс (ЭСИ), отражающий соотношение экспрессии указанных маркёров в эпителии и строме эндометрия. Показателем степени структурных изменений паренхиматозного и стромального компонентов в эндометрии стало соотношение относительных площадей эндометриальных желёз и окружающей стромы – железисто-стромальное соотношение (ЖСС), между железистым эпителием и стромой - эпителиально-стромальное соотношнние (ЭСС), соотношение просвета желёз и стромы (СПС).

  Статистический анализ проводили непараметрическим методом с помощью U-критерия Манна-Уитни. Для установления корреляции между структурными изменениями и уровнями экспрессии маркёров в паренхиме и строме эндометрия использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

         Проведённое морфометрическое исследование показало, что в нормальном эндометрии в фазе пролиферации строма преобладает над паренхимой: относительная площадь стромы равна 68,98±3,5%, площадь эндометриальных желёз составляет 31,02±1,6%, железисто-стромальное соотношение (ЖСС) равно 0,45 (р<0,05). Как известно паренхиматозный компонент в эндометрии представлен маточной железой, состоящей из эпителия и просвета железы. В норме относительная площадь эпителия равна 23,29±1,2%, что значительно больше относительной площади просвета желёз, которая составляет 7,73±0,4%. Соотношение между эпителиальным и стромальным компонентами в нормальном эндометрии поздней стадии пролиферации (эпителиально-стромальное соотношение – ЭСС) равно 0,34, соотношение просвета желёз и стромы (СПС) – 0,11.

При иммуногистохимическом исследовании достоверно (p<0,05) установлено, что пролиферация эпителия желёз значительно выше пролиферации клеток стромы. Об этом свидетельствует высокий уровень экспрессии маркёра пролиферации белка Ki-67 в  эпителии желёз эндометрия поздней фазы пролиферации, который составляет  68,75±3,5%, в строме нормального эндометрия экспрессия Ki-67 равна 10,25±0,5%. Эпителиально-стромальный индекс пролиферации по маркёру Ki-67 (ЭСИ Ki-67) в норме равен 6,71.

Эпителий желёз нормального эндометрия состоит из PTEN-позитивных клеток. Об этом свидетельствует 100% экспрессия онкомаркёра гена-супрессора рака PTEN в эпителии желёз эндометрия в поздней стадии пролиферации маточного менструального цикла. В строме нормального эндометрия содержание PTEN-позитивных клеток ниже и равно 65±3,3% (p<0,05). Значение ЭСИ PTEN эндометрия поздней стадии фазы пролиферации составляет 1,54.

В отличие от нормы, гистологические варианты ГЭ без атипии эпителия характеризуются изменением архитектоники эндометрия. Если в нормальном эндометрии поздней стадии пролиферации железы относительно мономорфны, извитые, иногда штопорообразные, продольная ось желёз ориентирована от миометрия к поверхности эндометри, то для простой ГЭ характерны многочисленные, не­равномерно распределенные железы, разной формы и величины, включая кистозно-расширенные. На отдельных участках желёз видны слабо выра­женные складки в направлении просвета желез.

 Железистый эпите­лий структурно мало отличается от эпителия желез эндометрия стадии пролиферации. Клетки железисто­го эпителия с овальными темноокрашенными ядрами, базофильной цитоплазмой, секрет в ней обычно отсутствует, местами имеются ми­тозы. Наряду с отдельными клетками маточного эпителия индифферентного и пролиферативного типов встречаются клетки трубного эпителия, светлые клетки, штифтиковые, выскальзывающие. В кистозно-расширенных же­лезах эпителий преимуществен­но однорядный, цилиндрический или уплощенный, митозы отсутству­ют.

При морфологической оценке гистологических препаратов с простой ГЭ создаётся впечатление преобладания желёз над стромой. Однако, полученные нами результаты морфометрического исследования свидетельствуют об обратном: относительная площадь паренхимы эндометрия при простой ГЭ равна 26,28±1,3%, стромы - 73,72±3,7% (р<0,05), железисто-стромальное соотношение (ЖСС) как и норме ниже единицы и равно 0,45.

Комплексная ГЭ отличается от простой ГЭ и нормального эндометрия не только явным увеличением количества эндометриальных желёз и уменьшением стромы, но и структурной перестройкой железистого компонента: среди многочисленных желез разной формы и величины преобладают «ветвящиеся», со складчатостью в направлении просвета железы, отмечается тенденция к компактному расположению желез. Железистый эпителий при комплексной ГЭ мало отличается от эпителия при простой ГЭ. Морфометрические показатели комплексной ГЭ свидетельствуют о менее значительном, но всё таки преобладанием стромального компонента над паренхиматозным: относительная площадь паренхимы эндометрия в комплексной ГЭ равна 42,01±2,1%, стромы - 57,99±2,9% (р<0,05), железисто-стромальное соотношение так же ниже единицы и равно 0,71.

Для комплексной атипической ГЭ характерны не только структурные, но и цитологические особенности. Многочисленные железы, разной формы и величины, расположены компактно, однако базальная мембрана сохранена. Несмотря на тесное расположение между соседними железам сохраняется узкая прослойка стромы из фибробластоподобных клеток. Большая часть желёз имеет причудливый «ветвистый» вид, с пальцеобразными инвагинациями в направлении их просвета и наличием микропапиллярных формирований, местами с образованием «эпителиальных перемычек».

Железистый эпителий многорядный с потерей полярности по отношению к базальной мембране. Ядра клеток округлой формы, везикулярного вида, с конденсацией хроматина вблизи ядерной мембраны, иногда с ядрышком. Отмечается повышенное ядерно-цитоплазматическое соотношение, однако, нередко цитоплазма клеток в значительном количестве эозинофильная или оксифильная. Митозы, как в клетках железистого эпителия, так и стромы – в вариабельном количестве, но наблюдаются патологические митозы.

В отличии от нормального эндометрия в поздней стадии пролиферации, простой и комплексной ГЭ, для комплексной атипической ГЭ характерно значительное преобладание паренхиматозного компонента над стромальным. Морфометрические показатели комплексной атипической ГЭ: S железы=54,71±2,7%, S стромы=45,29±2,3% (р<0,05), ЖСС=1,2.

Изменение паренхиматозно-стромального соотношения характеризуется проградиентным ростом доли эпителиального компонента и уменьшением площади просвета эндометриальных желёз в динамике от простой ГЭ и комплексной ГЭ и далее - к комплексной атипической ГЭ. Так, если в простой ГЭ относительные площади эпителия и просвета железы практически равны (S эпителия=13,29±0,7%, S просвета=12,99±0,7%), то при комплексной ГЭ площадь эпителия составляет 26,71±1,3%, а площадь просвета эндометриальных желёз равна 15,3±0,8% (р<0,05).

В комплексной атипической ГЭ морфометрический показатель относительной площади просвета эндометриальных желёз имеет наибольшие значение и составляет 24,4±1,2%. По сравнению с нормой, простой ГЭ и комплексной ГЭ возрос и морфометрический показатель относительной площади эпителия, который составляет по нашим данным 30,31±1,5% (р<0,05).

В основе указанных изменений лежит увеличение пролиферативной активности эпителия желёз в той же последовательности, что подтверждает наше иммуноморфологическое исследование, в котором достоверно установлен (р<0,05) постепенный рост экспрессии маркёра Ki-67 в эпителии при ГЭ: при простой ГЭ экспрессия маркёра составляет 13,36±0,7%, в комплексной ГЭ - 14,25±0,7%, комплексной атипической ГЭ - 58,3±2,9%.

Доказательством взаимосвязи между структурными изменениями в эндометрии и пролиферативной активностью эпителия желёз и клеток его стромы является также положительная корреляция между изменением эпителиально-стромального соотношения (ЭСС) и соотношения экспрессии маркёра пролиферации (ЭСИ) Ki-67 в эпителии и строме слизистой оболочки тела матки при разных гистологических вариантах ГЭ. Минимальные значения ЭСИ Ki-67 при простой ГЭ (0,74) отражает превышение стромальной экспрессии (18±0,9%) над эпителиальной (13,36±0,7%) и выражается в преобладании стромального компонента в эндометрии над эпителиальным. Этот показатель в 9 раз отличается от значений  ЭСИ Ki-67 нормального эндометрия поздней стадии пролиферации, который равен 6,71. Проградиентное увеличение значения ЭСИ Ki-67 при прогрессировании процесса от простой гиперплазии к комплексной ГЭ (2,48 ) и затем – к комплексной атипической ГЭ (3,33) находит своё отражение в постепенном увеличении эпителиального компонента. Таким образом, используемые нами индексы соотношения между морфометрическими показателями, отражающими структурные изменения в эндометрии и иммуногистохимическими показателями, отражающими соотношение экспрессии маркёра пролиферации в эпителии и строме эндометрия, объективно показывают, что основным звеном в механизме изменения структуры эпителиально-стромальных взаимоотношения является эпителий эндометриальных желёз.

Установленные изменения показателей эпителиальной и стромальной пролиферации свидетельствует о нарушении баланса в уровне пролиферативной активности между эпителием желёз и клетками стромы при ГЭ. Вероятно, причина дисбаланса заключается во включении каких-то генетических механизмов, приводящих к нарушению соотношения созревания клетки и апоптоза, что усиливает потенциал пролиферации. Для понимания этих механизмов мы исследовали ген PTEN, т.к. известно, что белковый продукт гена PTEN участвует в регуляции клеточного цикла и апоптоза. Он сигнализирует клетке о необходимости прекращения деления и способствует ее вступлению в апоптоз. По-видимому, таким образом, белок гена PTEN осуществляет супрессорную функцию в отношении клеточной пролиферации. Инактивация этой функции может вести к бесконтрольному клеточному росту и возникновению опухоли.

Из литературы известно, что инактивирование PTEN в клетках приводит к стимуляции клеточной пролиферации (Waite K. A., 2002). В наших исследованиях было установлено, что в эпителии желез при простой ГЭ и комплексной ГЭ  количество PTEN-позитивных эпителиальных клеток и стромы незначительно ниже (96±4,8% и 97,88±4,9% соответственно), чем в нормальном эндометрии (100%). Вместе с тем, при комплексной атипической ГЭ установлено значительное уменьшение PTEN-позитивных клеток (79,43±4%) (р<0,05). Одновременно мы выявили в гиперплазированом эндометрии  отрицательную корреляцию между морфометрическими и иммуногистохимическими показателями эпителиально-стромальных взаимоотношений. Такая корреляция между ЭСИ PTEN и ЭСИ Ki-67, ЭСИ PTEN и ЭСС указывает на то, что высокое содержание PTEN-позитивных эпителиальных и стромальных клеток эндометрия при простой ГЭ и комплексной ГЭ обусловливает их низкую пролиферативную активность.

Причины изменения активности гена PTEN при различных вариантах ГЭ остаются не совсем понятными, однако, наше исследование позволяет связать пролиферацию клеток эндометрия, характер и степень этой пролиферации с состоянием активности гена PTEN и проследить соответствующие  изменения эпителиально-стромальных взаимоотношений при этой патологии. Вероятно, при гиперплазии эндометрия происходит угнетение апоптоза клеток слизистой оболочки матки и соответственно активизация пролиферативных процессов в ней. Следует отметить, что при исследовании гистологического материала мы практически не видели проявлений апоптоза в соскобах эндометрия и в операционном материале. Однако выявленные нами изменения соотношения эпителиально-стромальных компонентов эндометрия несомненно нарушает физиологические параметры его метаболизма, изменяет гомеостаз слизистой оболочки, что отражается на циклических деструктивно-пролиферативных процессах в эндометрии.

При этом не исключено, что степень угнетения активности гена PTEN определяет злокачественный потенциал гиперплазии эндометрия и переход простой ГЭ и ее вариантов в эндометриальную интраэпителиальную неоплазию, которую можно рассматривать как дисплазию, носящую характер облигатного предрака.

Эндометриальная интраэпителиальная неоплазия качественно отличается от ГЭ. Если гиперплазия эндометрия характеризуется диффузным поражением всего эндомертия, то ЭИН носит очаговый характер поражения слизистой оболочки матки. Наши морфометрические исследования ЭИН показали выраженные изменения эпителиально-стромальных соотношений при этой патологии - низкое содержание стромы (41,42±2,1%) и значительное преобладание паренхимы (58,58±2,9%) (p<0,05), что отмечают и другие авторы (Mutter C.L. et al., 2000, Orbo A. et al., 2008). Вместе с тем, по морфометрическим и иммуногистохимическим показателям, отражающие эпителиально-стромальные взаимоотношения ЭИН занимает промежуточное положение между различными вариантами ГЭ и эндометриоидной аденокарциномой.  Так, если эпителиально-стромальное соотношение (ЭСС) при ЭИН равно 0,87, то для комплексной атипической ГЭ этот показатель составляет 0,67, а в ЭА - 1,03; железисто-стромальное соотношение (ЖСС) при ЭИН равно 1,41, в то время, как при КАГЭ оно составляет 1,21, а при ЭА - 1,43.

Иммуногистохимические критерии ЭИН так же отличают ее как от гиперплазии, так и от рака эндометрия. ЭИН характеризуется почти полным отсутствием PTEN-позитивных клеток эпителия и стромы (ЭСИ PTEN равен 0,5) и соответственно высокой пролиферативной активностью эпителия – эпителиально-стромальный индекс (ЭСИ) маркёра Ki-67 наибольший и равен 5,41 (ЭСИ КАГЭ=3,33; ЭСИ ЭА=4,65). При этом от эндометриоидной аденокарциномы ЭИН отличает отсутствие инвазии в строму эндометрия.

Таким образом, результаты проведённого комплексного исследования   позволяют расценивать эндометриальную интраэпителиальную неоплазию  как самостоятельную нозологическую единицу, занимающую промежуточное положение между ГЭ и ЭА, и которая отличается от них по ряду иммуноморфологических критериев. 

В результате проведенного ИГХ-исследования, нами установлено, что  эндометриоидная аденокарцинома по признаку экспрессии PTEN делится на два иммунофенотипа: PTEN-негативные ЭА с полной или частичной инактивацией гена, содержащие 1% PTEN-позитивных клеток эпителия желёз и 2% клеток стромы, и PTEN-позитивные, сохранившие неизменённый ген в 86,83±4,3% клетках эпителия и 76,25±3,8% клетках стромы. Морфологически оба фенотипа высокодифференцированной ЭА выглядят одинаково: это железистые образования, преимущественно тубулярного строения, в отдельных участках папиллярного строения. Эпителий опухолевых желёз эндометриального типа, клетки цилиндрические или кубические с повышенным ядерно-цитоплазматическим соотношением, располагаются то однорядно, то многорядно. Ядра часто гиперхромные, полиморфные. Число фигур патологических митозов может быть различным. Паренхима значительно преобладает над стромой, которая располагается между железами в небольшом количестве, а в участках ЭА криброзного строения вообще отсутствует. Имеет место инфильтрирующий рост опухоли в строму эндометрия и миометрий.

Морфометрические показатели обоих иммунофенотипов также одинаковы: относительная площадь опухолевых желёз составляет по нашим данным 58,8±2,9%, стромы - 41,2±2,1%. Имеет место значительное увеличение относительной площади эпителия до 42,32±2,1% и уменьшения площади просвета желёз – 14,98±0,8%. Соотношение паренхимы к строме (ЖСС) наиболее высокое и составляет 1,43, эпителиально-стромальное соотношение, которое равно 1,03, также выше по сравнению с ЭИН и различными вариантами ГЭ.

Обсуждая вероятность развития эндометриоидного рака, следует отметить, что его морфогенез представляет собой сложный молекулярно-генетический процесс, приводящий к образованию злокачественных опухолей эндометрия, имеющих одинаковую структуру, но разный иммунофенотип и, вероятно, может происходить двумя путями. Проведённое исследование указывает на ключевую роль гена PTEN в морфогенезе ЭИН и PTEN - негативной ЭА. О тесной морфогенетической связи между облигатным предраком (ЭИН) и эндометриоидной аденокарциномой свидетельствуют равные значения эпителиально-стромальных индексов по PTEN ЭИН (0,5) и PTEN-негативной ЭА (0,5). Основываясь на результатах нашего и ряда других исследований, можно предположить, что потеря функции гена PTEN вначале ведёт к возникновению предракового повреждения, которое является моноклональным, то есть к ЭИН, которая затем и трансформируется в PTEN-негативную ЭА. Таким образом, один путь развития рака эндометрия следует через ЭИН. Поскольку показатель эпителиально-стромальных взаимоотношений в эндометрии гена-супрессора рака в PTEN-позитивной ЭА сопоставим со значениями комплексной ГЭ с атипией, то можно предположить, что между эндометриоидной аденокарциномой, содержащей клон PTEN-положительных эпителиальных и стромальных клеток и атипической ГЭ по всей видимости нет промежуточных звеньев. Следовательно, PTEN-позитивный эндометриоидный рак развивается из атипической гиперплазии эндометрия, минуя ЭИН.