Механізми порушень сурфактантної системи і гемоциркуляції в малому колі кровообігу при набряку легень : Механизмы нарушений сурфактантной системы и гемоциркуляции в малом круге кровообращения при отеке легких

summary

 Матеріали і методи дослідження. Дослідження виконані на 546 тваринах, а саме: на 528 білих нелінійних щурах-самцях масою 180–220 г і 18 кролях-самцях породи шиншила масою 4,0–5,0 кг, вирощених у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ, які знаходилися на стандартному харчовому і водному раціоні згідно зі санітарно-гігієнічними нормами. Протягом експерименту з тваринами обходилися згідно з міжнародними принципами «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують для експериментальних і інших наукових цілей» (Страсбург, 18.03.86) і «Загальних етичних принципів досліджень на тваринах» (Україна, 2001), витяг з протоколу № 11 засідання Комітету з біоетики НФаУ від 20.11.08. Усі больові маніпуляції були проведені під етамінал-натрієвим наркозом.

Дослідження проведені на двох моделях набряку легень: гемодинамічного (адреналінового) і гострогіпоксичного. Гемодинамічний набряк легень викликали шляхом внутрішньом’язового уведення щурам  адреналіну гідрохлориду в дозі 5 мг/кг, кролям – в дозі 0,5 мг/кг (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000). Для відтворювання гострогіпоксичного набряку легень використовували модель, розроблену у відділі по вивченню гіпоксичних станів Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. За цією методикою тварини дихали гіпоксичною газовою сумішшю, яка містила 7 % О₂ в азоті, одноразово протягом 1 год. Вибір гіпоксичної суміші вказаного складу для моделювання гострогіпоксичного набряку легень обумовлений тим, що зниження концентрації кисню в дихальній газовій суміші до 7 % сприяє виявленню меж пристосувальних можливостей організму як на системному, так і на тканинному рівнях і, безсумнівно, викликає в легенях зміни, які призводять до набряку легень. Гіпоксичні умови для тварин створювали в герметичній камері з постійним потоком газової суміші та поглинанням вуглекислого газу.

Відомо, що ренін-ангіотензин-альдостеронова система відіграє важливу роль у регуляції артеріального тиску (АТ), електролітного і водного балансу (Запорожан В.Н., Свирский А.А., Гоженко А.И. и др., 2001), у зв’язку з чим фармакологічна блокада цієї системи на будь-якому рівні може давати позитивні ефекти в лікуванні набряку легень. Для встановлення деяких ланок патогенезу набряку легень і дослідження впливу інгібіторів АПФ на його розвиток в роботі застосовували препарати «Енап» (KRKA, Slovenіa), який вводили внутрішньовенно в дозі 18 мкмоль/100 г маси тіла, і «Зофеноприл» («Зокардіс») (Berlin-Chemie, Німеччина), який вводили в дозі 3,5 мг/кг внутрішньочеревно.

Ультраструктурні особливості сурфактантної системи при набряку легень вивчали за допомогою електронно-мікроскопічного дослідження легеневої тканини у щурів на моделі гострогіпоксичного набряку легень. Підготовку препаратів для електронно-мікроскопічних досліджень виконували з подвійною фіксацією глютаральдегідом та OsO₄, зневоднюванням у спиртах зростаючої концентрації та заливкою в епон (Карупу В.Я., 1984; Автандилов Г.Г., 2002). Ультратонкі зрізи товщиною 40–60 нм фіксували уранілацетатом та цитратом свинцю. В роботі використані електронні мікроскопи JEM 100-CX (Японія) та
ПЕМ-125 К (Україна). Дослідження ультраструктури сурфактантної системи виконані на 7 групах щурів: 1-ша – інтактні тварини; 2-га – тварини з набряком легень, досліджені через добу після гострогіпоксичного впливу; 3-тя – тварини з набряком легень, досліджені через тиждень; 4-та – щури, яким з профілактичною метою перед гіпоксичним впливом протягом 2 діб вранці та ввечері внутрішньовенно вводили енап, досліджували через добу після впливу гіпоксії;
5-та – аналогічна 4-й групі, але тварин досліджували через тиждень; 6-та – щури, яким з лікувальною метою після гіпоксичного впливу одноразово вводили енап, досліджували через добу після гострогіпоксичного впливу; 7-ма – тварини, яким після гострогіпоксичного впливу протягом тижня вводили енап і після цього досліджували.

Морфометричну і стереометричну оцінку мітохондріального апарату легень проводили за такими показниками, як загальна кількість мітохондрій, кількість структурно змінених мітохондрій, середній діаметр мітохондрій, сума поверхонь мітохондрій в одиниці об’єму легеневої тканини. Морфометричні дослідження проводили у відповідності до методик Вейбеля (Menezes S.L.S., 2005), а також з використанням комп’ютерної програми для морфологічних підрахунків Image Tool Version 3 (Техас, США) (Осипов В.П., 2003).

Для дослідження фосфоліпідного складу сурфактантної системи і кардіоміоцитів спочатку відокремлювали ліпідну фракцію з тканин за методом Фолча шляхом розчинення у суміші хлороформу з метанолом (2:1) (Folch J., 1957). Для розділення фосфоліпідів на окремі фракції використовували метод двовимірної тонкошарової хроматографії (Климов В.И., 1995).

Вміст вільних сульфгідрильних груп у тканині легень визначали на моделях адреналінового і гострогіпоксичного набряку легень методом амперометричного титрування 0,001N розчином сулеми за методикою J.M. Kolthoff  и W.E. Harris в модифікації С.Н. Ністратової.

Для оцінки гемодинамічних порушень при набряку легень знімали електрокардіограму у ІІ стандартному відведенні на 6-канальному електрокардіографі «Биосет-6000», катетеризували лівий і правий відділи серця, легеневу артерію і аорту і записували тиск крові за допомогою електроманометрів (Минго­граф-740, фірма «Siemens», Німеччина). Швидкість кровотоку визначали на ділянці «праве серце – вухо» шляхом введення барвника і визначення його появи за допомогою вушних датчиків оксигемографа. Методом розведення барвника вимірювали центральний об’єм крові. Хвилинний об’єм крові (ХОК), частоту серцевих скорочень (ЧСС), загальний периферичний опір, загальний легеневий опір, тиск у легеневій артерії визначали через кожні 60 хв протягом 6 год після відтворення набряку легень (Зотов Д.Д., 2002).

Для оцінки мікроциркуляторних порушень в тканині легень методом при­життєвої біомікроскопії визначали діаметр артеріол, венул, капілярів, довжину функціонуючих капілярів і візуально оцінювали характер кровотоку в них за допомогою електронного мікроскопа JEM 100-CX (Японія) (Автандилов Г.Г., 2002).

Для вивчення бар’єрної і метаболічної функції легень визначали вміст в крові і тканинах адреналіну, норадреналіну, гістаміну, серотоніну, ацетилхоліну, ацетилхолінестерази і моноаміноксидази (МАО). Вміст адреналіну і норадреналіну у периферичній крові визначали флюорометричним методом за У. Ейлером і Ф. Лішайко в модифікації Е.Ш. Матліної (Матлина Э.Ш., 1967). Адреналін і норадреналін в тканинах надниркових залоз, міокарда, легень визначали флюорометричним методом Е.Ш. Матліної в модифікації В.О. Осинської (Меньшиков В.В., 1987). Рівень 5-гідрокситриптаміну (5-ГТ, серотонін) в крові визначали флюорометричним методом по реакції з ортофталевим діальдегідом (Камышников В.С., 2004). Вміст гістаміну визначали  шляхом вимірювання флюоресценції продуктів конденсації гістаміну з ортофталевим альдегідом за методом І.С. Балаховського (Меньшиков В.В., 1987). Активність сироваткової холінестерази визначали колориметричним методом з використанням індикатору за зміною кольору буферного розчину (Камышников В.С., 2004). Активність МАО визначали за методом Д.М. Аронової і З.М. Кисельової, який ґрунтується на здатності МАО перетворювати бензоламін в бензальдегід (Гончарова В.А., 1983).

Структурно-функціональний стан еритроцитів оцінювали за їх здатністю до деформації: визначали індекс деформації еритроцитів, відносну в’язкість еритроцитарної суспензії за методом А.Ф. Пирогової у модифікації М.А. Котов­щикової і З.Д. Федорової (Меньшиков В.В., 1987). Для оцінки агрегатного стану крові визначали показники гемокоагуляції: час згортання; час рекальцифікації цитратної плазми за Howell; тромбіновий час за Biggs, Macfarlane; протромбіновий індекс за Quick; вміст фібриногену за Рутбергом і активність вільного гепарину (Баркаган З.С., 2001; Меньшиков В.В., 1987).

Про стан перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) судили за рівнем дієнових кон’югатів (ДК), гідропероксидів ліпідів у сироватці крові і малонового діальдегіду (МДА) в еритроцитах. Вміст ДК у плазмі крові визначали спектрофотометричним методом. Вміст гідропероксидів ліпідів у плазмі крові визначали за методом В.Б. Гаврилова і М.І. Мишкорудної, який складається з двох етапів: екстракції гідропероксидів ліпідів жиророзчинниками і спектрофотометричного визначення їх оптичної щільності. Рівень МДА  в еритроцитах крові визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою і утворенням забарвленого комплексу (Камышников В.С., 2004).

Про стан антиоксидантної системи (АОС) судили за концентрацією в сироватці крові основного неферментативного антиоксиданту α-токоферолу, активністю позаклітинного антиоксидантного ферменту церулоплазміну, відновленого глутатіону (GSH) в гемолізатах еритроцитів, активністю глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г-6-ФДГ), загальної антиоксидантної активності (ЗАА). Рівень α-токоферолу у плазмі крові визначали після екстрагування α-токо­феролу плазми сумішшю етанол-гексан і випарювання гексанової фракції, додавали хлорне залізо, яке здатне відновлюватися з тривалентного стану у двовалентний під дією α-токоферолу. Про кількість α-токоферолу судили за вмістом відновленого заліза, який визначали реакцією з α-2-дипиридилом, що супроводжується утворенням комплексу червоного кольору (Камышников В.С., 2004). Активність церулоплазміну в сироватці крові визначали за методом
Равіна з використанням у якості  субстрату парафенілендіаміну (Камышников В.С., 2004). Для визначення активності глутатіону застосовували метод, принцип якого базується на реакції сульфгідрильних груп з реактивом Еллмана (5,5¢-дітіобіс(2-нітробензойна кислота). ЗАА визначали інгібуванням окиснення твіну-80 та хемілюмінометрично за ступенем інгібування аскорбат- і фероіндукованого окиснення твіну-80 до МДА («Дослідження пероксидної оксидації та антиоксидантного захисту організму в клінічній практиці (методичні рекомендації)». Львів, 2002).

Ультраструктуру міокарда при набряку легень вивчали на моделі гемодинамічного набряку легень. Для морфологічного вивчення забирали тканину вушок лівого і правого передсердь. Ультратонкі зрізи контрастували цитратом свинцю і уранілацетатом та вивчали за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-125 К (Україна). У кожного експериментального щура в кардіоміоцитах визначали відносний об’єм секреторних гранул, міофібрил, мітохондрій, агранулярного саркоплазматичного ретикулуму, Т-системи й остових структур цитоплазми методом точкового розрахунку (Автандилов Г.Г., 1990, 2002;
Карупу В.Я., 1984). Підрахунок проводили в 30 полях зору.

ПНУФ у передсердях і плазмі крові  визначали радіоімунологічним методом (Постнов А.Ю., 1987). При заборі крові використовували катетер, який вводили в яремну вену за добу до забору проби крові.

Вміст натрію в крові і сечі досліджували методом полум’яної фотометрії (Камышников В.С., 2004).

Вивчення паттерну дихання проводили на моделі гострогіпоксичного набряку легень. На ненаркотизованих щурах вивчали показники зовнішнього дихання, альвеолярної вентиляції, часових інтервалів дихального циклу та газообміну, які вимірювали із застосуванням дослідної установки для вивчення об`ємно-часових параметрів дихання та газообміну у лабораторних тварин, з використанням спеціальної дихальної маски з вмонтованим капіляром масспектрографа МХ-6202, через який проводили безперервний відбір проб альвеолярного повітря. Альвеолярну вентиляцію розраховували за киснем з використанням рівняння Бора. Показники об’ємів приводилися до системи VTPS, показники газообміну – до системи STPD (Гриппи М., 2005). Для реєстрації змін показників паттерну дихання, газообміну та інших в динаміці дослідження наркотизованих щурів приєднували до установки через трахеостомічну канюлю
(Емельянов Н.А., 1971).

Статистичну обробку результатів дослідження проводили з використанням комп’ютерної програми Stadia-6,0 і t-критерію Стьюдента (Сернов Л.Н., Гацура В.В., 2000), а також за допомогою програм Excel (Осипов В.П., 2003).