МЕХАНІЗМИ РЕАКЦІЙ МЕТАБОЛІЗМУ ТА ЕЛІМІНАЦІЇ ГІДАЗЕПАМУ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ : МЕХАНИЗМЫ РЕАКЦИЙ МЕТАБОЛИЗМА И элиминации гидазепама в организме крыс

summary

Матеріали та методи дослідження. Всі дослідження були виконані з використанням похідного 1,4-бенздіазепіну гідазепаму, та його аналогів, що мали радіоактивний ізотоп у гетерокільці та гідразидному фрагменті з радіохімічною чистотою 91–98 % та питомою активністю 0,003 та 0,07 Ки/моль відповідно. Препарати були синтезовані в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (Одеса).

Досліди були проведені на 180 білих щурах лінії „Wistar” вагою 180–220 г та 90 безпородних мишах масою 18–25 г. Дослідження проводили у відділі Фізико-хімічної фармакології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України відповідно до вимог Комітету з біоетики Державного фармакологічного центру МОЗ України (Посвідчення протоколу № 20 від 20 вересня 2005 р.).

При вивченні елімінації, метаболізму та екскреції сполук, що досліджувались, гідазепам та його метаболіти вводились інтрагастрально у дозах 5 мг/кг, що відповідало ED₅₀ за анксиолітичною дією препарату у дослідах на щурах [Андронати С.А., Воронина Т.А., 1992]. Після введення радіоактивного матеріалу збирали зразки сечі та калу через певні проміжки часу 12–120 год. При визначенні протисудомної дії сполук перорально вводили гідазепам та його метаболіти у дозі 7 мг/кг. Вибір дози препарату ґрунтувався на підставі попередніх досліджень його фармакодинаміки [Головенко Н.Я., Зиньковский В.Г., 1999] та є оптимальною для кількісного визначення загального радіоактивного матеріалу. Контрольним тваринам вводились відповідні об’єми фізіологічного розчину у твіновій суспензії. У роботі було проведено оптимізацію та валідацію аналітичного методу у кількісному визначенні ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів.

У дослідах визначення протисудомної активності гідазепаму, у коразоловому тесті, тваринам внутрішньоочеревинно вводили гідазепам та його метаболіти у дозах 0,16–1,5 мг/кг за 30 хв до підшкірного введення коразолу в дозі 125 мг/кг, яка викликає 95 % тонічну екстензію у мишей. Реєстрацію тонічної екстензії проводили протягом години [Головенко М.Я., Громов Л.О., 2003]. Визначення протисудомного ефекту гідазепаму та його метаболітів при пароксизмальній активності центральної нервової системи проводились в умовах гострого експерименту (електроенцефалографічні досліди). За 30 хв до створення судомної дії вводились протисудомні засоби, такі як гідазепам та його потенційні метаболіти. Судомні агенти (коразол та пікротоксін), аплікували на кору головного мозку.

Визначення гострої токсичності сполук (LD₅₀) проводилось протягом 24 год, після їх введення. За літературою [Seredenin S. B., Blednov Y. A., 1998] тваринам перорально вводили засоби у дозах 2000 – 500 мг/кг.

Розділення гідрофільних та ліпофільних метаболітів проводили у роздільній лійці у системі хлороформ – вода (1:1). Подальше вивчення метаболітів та шляхів елімінації засобів, що утворились в процесі біотрансформації вихідної сполуки, здійснювалось методом препаративної тонкошарової хроматографії та визначенням вмісту індивідуальних радіоактивних сполук.

У дослідах визначення ізоформ CYP450 тварин було поділено на групи. Першій групі (контроль) перорально вводився мічений гідазепам (5 мг/кг). Тваринам другої групи протягом чотирьох діб вводився індуктор CYP450 – фенобарбітал (80 мг/кг), а на п’яту добу – ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг). Іншій групі тварин вводили протягом чотирьох діб модифікатор CYP450 – омепразол (80 мг/кг), на п’яту добу вводився ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг).

Останній групі тварин вводився інгібітор ферменту CYP450 – кетоконазол (80 мг/кг), та на п’яту добу – ¹⁴С-гідазепам (5 мг/кг). Зразки сечі та калу збирали протягом п’яти діб після введення радіоактивного матеріалу. Весь цей час тварини знаходились у метаболічних комірках.

Вміст ¹⁴С-гідазепаму та його метаболітів у зразках, що досліджувались, проводилось методом сцинтиляційної рідинної фотометрії на приладі „Canberra-Packard TRI-CARB 2700 TR” (USA).

Обробку отриманих результатів проводили відповідно до алгоритмів [Соловьев В.Н., Фирсов А.А., 1980]. При порівняльному аналізі результатів досліджень використовувались параметричні критерії Ст’юдента [Гланц С., 1999]. Довірчий інтервал у всіх дослідах розраховувався при рівні значимості Р≤0,05, що гарантує вірогідність результатів з імовірністю 0,95.

Усі отримані результати обробляли загальноприйнятими в медико-біологічних дослідженнях методами статистичного аналізу з використанням стандартних пакетів комп’ютерних програм [Лапач С.Н. и сооавт., 2002].