МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ РЕПЕРФУЗІЙНОГО СИНДРОМУ В УМОВАХ ВПЛИВУ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ : МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ реперфузионного синдрома В УСЛОВИЯХ воздействием ионизирующего излучения И ИХ КОРРЕКЦИЯ

summary

Матеріал і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 164 білих щурах-самцях лінії “Vistar”, масою 180-200 г. Тварини утримувалися в стандартних ідентичних умовах, що необхідно для створення структурної групи. Експериментальну дію іонізуючого випромінювання здійснювали шляхом впливу на тварин одноразового тотального опромінення з використанням гамма-терапевтичного апарату “АГАТ-Р1” (⁶⁰З) на базі відділення радіології КРУ “РКБ ім. М. О Семашка” м. Сімферополя при наступних умовах: доза 6 Гр, поле 24 х 24, ВД=90 см, глибина =3 см (89,6 %), Р=1,155 сГр/с, тривалість експозиції 580 с. Реперфузійний синдром моделювали безпосередньо після впливу гамма-опромінення шляхом накладення гумових джгутів на обидві задні кінцівки тварин на рівні пахової складки строком на 6 годин під легким ефірним наркозом, використовуючи модифікацію В. З. Харченка (посвідчення на раціоналізаторську пропозицію № 1786, видане Кримським державним медичним інститутом 28.09.89 р.). Ширина передавлення тканин становила 2–3 мм.

Введення препаратів для патогенетичної корекції проводилось одноразово інтраперитонеально перед реваскуляризацією кінцівок. В якості інгібітору протеїназ застосовували контрикал (“AWD. pharma GmbH & Co. KG. Drezden” – Німеччина). В якості антиоксиданту використовували корвітин, що є водорозчинною формою біофлавоноїду кверцетину (ЗАТ НПЦ “Борщаговський хіміко-фармацевтичний завод”, Україна). Дози досліджуваних препаратів були підібрані, виходячи із середніх терапевтичних доз, використовуваних у клініці на 1 кг маси. Препарати вводили одноразово перед зняттям джгутів. Контрикал вводили в дозі 10 000 АтрОД/кг маси, розведений в ізотонічному розчині натрію хлориду, з розрахунку 10 мл/кг маси. Використовувана доза контрикалу ефективно знижує активність неспецифічних протеїназ і підвищує рівень їхніх інгібіторів у сироватці крові щурів при моделюванні реперфузійого синдрому (Н. Ю. Горохова, 2003). Корвітин вводили в дозі 10 мг/кг маси тіла, розведений в ізотонічному розчині хлориду натрію, з розрахунку 10 мл/кг маси. Згідно літературним даним, зазначена доза препарату успішно застосовується для корекції реперфузійного синдрому в кардіологічній практиці (Н. П. Максютіна та співавт., 2000). Щурам контрольної та експериментальної груп без лікування вводили ізотонічний розчин хлориду натрію, з розрахунку 10 мл/кг маси тіла.                                                                                                                    

Кров для досліджень у щурів одержували шляхом декапітації під легким ефірним наркозом. Сироватку крові одержували з нестабілізованої крові шляхом центрифугування після попереднього охолодження. Гомогенати тканин печінки, нирки і слизовій оболонки тонкого кишечнику одержували за методикою, описаною Р. Скоупс (1985) і И. М. Скрипник (2001).                       Трипсиноподібну активність (ТПА) сироватки крові вимірювали спектрофотометричним методом (А. В. Кринская та  співавт., 1977). Вимір еластазоподібної активності (ЕПА) сироватки проводили за гідролізом синтетичного субстрату N-t-BOC-аланіл-p-нітрофенілового ефіру (Reanal) (О. Г. Оглоблина и соавт., 1980). Визначення активності б₁-інгібітору протеїназ (α₁-ІП) в сироватці крові та антитриптичної активності (АТА) у  супернатантах гомогенатів печінки та нирок проводили уніфікованим методом В. Ф. Нартикової та Т. С. Пасхіної (1977). Для визначення кислотостабільних інгібіторів (КСІ) у сироватці крові проби попередньо обробляли для осадження кислотолабільних білків. Для визначення рівня кислотостабільних інгібіторів печінки, нирки й слизової тонкого кишечнику 1 мл супернатантів гомогенатів обробляли 0,112 мл 50 % трихлороцтової кислоти і здійснювали експозицію на водяній бані при 60 °С. Після охолодження і нейтралізації розчином 3 н NаOH отриманий 5 %-ний ТХО-екстракт центрифугували. Подальше визначення рівня кислотостабільних інгібіторів проводили за алгоритмом, аналогічним до методиці визначення антитриптичної активності (О. Г. Оглоблина и соавт., 1980; В. Ф. Нартикова и соавт., 1969). Інтенсивність ПОЛ в сироватці крові оцінювали за концентрацією ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) (С. Н. Суплотов и соавт., 1986; Ю.А. Владимиров и соавт., 1972). Визначення антиокислювального потенціалу включало дослідження пероксидазоподібної (ППА) і каталазоподібної активностей (КПА) (Т. Попов и соавт., 1971; М. А. Королюк и соавт., 1988), оцінку церу­лоплазміну (ЦП) (Д. Е. Дубинина и соавт., 1983) і супероксиддисмутази (СОД) (С. Чевари и соавт., 1985).                                 Для оцінки патоморфологічних змін в тканинах серця, легень, нирок, печінки, тонкого кишечнику застосовували метод світлової мікроскопії. Перегляд і цифрові фотографії мікропрепаратів здійснювали за допомогою світлового мікроскопа “Olympus CX-41”.     Статистична обробка одержаних даних проведена з використанням методів варіаційної статистики з обчисленням середніх величин (M) і оцінкою середньої помилки (m), достовірними вважали показники при p<0,05 за Стьюдентом (Д. Тинни, 1970). Аналіз відносних величин проводився з урахуванням критичних значень коефіцієнтів лінійної кореляції Пірсона r (З. Н. Лапач та співавт., 2001). Статистичні методи були доповнені визначенням парного критерію Вілкоксона (Т) (Е. В. Гублер и соавт., 1969). Статистичні розрахунки виконували в середовищі електронних таблиць Exel для Microsoft Office. Всі виміри і дослідження здійснювалися на устаткуванні, що пройшло метрологічну перевірку та експертизу.                                              Результати власних досліджень та їх обговорення. Проведені нами дослідження показали, що розвиток реперфузійного синдрому, обтяженого впливом іонізуючого випромінювання, супроводжується значною активацією процесів протеолізу в сироватці крові, при цьому надходження токсинів з раніше ішемізованих тканин має важливе значення у патогенезі дисбалансу протеїназ-інгібіторної системи. Так, при моделюванні реперфузійного синдрому на тлі впливу іонізуючого випромінювання через 6 годин після реваскуляризації кінцівок рівень ТПА у сироватці крові підвищився на 64,5 % (p<0,001) порівняно з інтактними тваринами, а через 12 годин перевищував показники контрольної групи на 98,7 % (p<0,001). У сироватці крові тварин усіх груп з реперфузійним синдромом, обтяженим впливом іонізуючого випромінювання, спостерігалося зниження рівня ЕПА. К 6-ій годині дослідження ЕПА знизилася на 51,3 % (p<0,001), а через 12 годин після реваскуляризації кінцівок зниження активності еластази склало 65,8 % (p<0,001) порівняно з контрольними показниками. Підвищення активності трипсиноподібних протеїназ у сироватці крові  супроводжувалося прогресуючим падінням рівня їх інгібіторів. Так, к 6-ій годині дослідження активність б₁‑ІП у сироватці крові знизилася на 32,1 % (p<0,001), а через 12 годин – на 15,6 % (p<0,01) порівняно з показниками контрольної групи. К 6-ій годині дослідження рівень КСІ зріс на 18,1 % (p<0,01), а через 12 годин після реваскуляризації кінцівок цей показник знизився на 19,9 % (p<0,01) порівняно з контролем.

Значні зміни стану протеїназ-інгібіторної системи було виявлено і на локальному рівні, у тканинах органів-мішеней. Так, в усіх серіях експериментів розвиток комбінованого радіаційно-реперфузійного ураження супроводжувався значним підвищенням ТПА в супернатантах гомогенатів печінки. Вже через 6 годин  після реваскуляризації кінцівок цей показник був максимально виразним і перевищував контрольні значення  на 94,6 % (p<0,01), а к 12-ій годині дослідження рівень ТПА був вище за контроль на 41,8 % (p<0,01). Підвищення рівня ЕПА в супернатантах гомогенатів печінки мало менш виразний характер. При цьому, через 6 годин після зняття джгутів цей показник зріс на 19,1 % (p<0,01), а через 12 годин – лише на 4,4 % (p>0,5) у порівнянні з контролем. Моделювання реперфузійного синдрому, обтяженого впливом іонізуючого випромінювання, супроводжувалося прогресуючою динамікою падіння активності інгібіторів протеїназ у супернатантах гомогенатів печінки. Так, зниження АТА через 6 годин після реваскуляризації кінцівок досягло 31,6 % (p<0,001), а через 12 годин – 65,8 % (p<0,001) порівняно з показниками інтактних тварин. При цьому к 6-ій годині дослідження спостерігалося підвищення рівня КСІ в супернатантах гомогенатів печінки на 17,6 % (p<0,01) , яке змінилося його падінням на 46,8 % (p<0,001) порівняно з контролем через 12 годин після зняття джгутів.

Стан протеїназ-інгібіторної системи в супернатантах гомогенатів нирок при розвитку комбінованого радіаційно-реперфузійного ураження також характеризувався переважанням активності протеїназ над рівнем їх інгібіторів. Так, рівень ТПА в супернатантах гомогенатів нирок к 6-тій годині дослідження зріс на 25,3 % (p<0,01), а через 12 годин після зняття джгутів – на 21,3 % (p<0,01) порівняно з показниками інтактних тварин. ЕПА через 6 і 12 годин після реваскуляризації кінцівок зросла у порівнянні з контролем на 24,6 % (p<0,01) та 18,6 % (p<0,05) відповідно.

Підвищення протеолітичної активності в супернатантах гомогенатів нирок супроводжувалося виснаженням місцевого інгібіторного потенціалу. При цьому максимально виразне падіння АТА спостерігалося через 6 годин після реваскуляризації кінцівок

Розвиток реперфузійного синдрому на тлі впливу іонізуючого випромінювання супроводжувався значними змінами активності протеїназ в супернатантах гомогенатів слизової оболонки тонкого кишечнику. Динаміка рівня ТПА характеризувалася зміною періодів  зниження активності через 6 і 24 години після реваскуляризації кінцівок на 34,5 % (p<0,05) и 18,9 % (p<0,001) відповідно та її підвищення на 44,9 % (p<0,01) через 12 годин. Рівень ЕПА в супернатантах гомогенатів слизової оболонки тонкого кишечнику при моделюванні реперфузійного синдрому на тлі впливу іонізуючого випромінювання значно підвищувався. Так, через 6 годин після зняття джгутів рівень ЕПА підвищився на 69,4 % (p<0,001), а к 12‑тій годині дослідження – на 270,7 % (p<0,001) у порівнянні з контролем.

Таким чином, розвиток реперфузійного синдрому на тлі впливу іонізуючого випромінювання супроводжувався зниженням антипротеазного захисту організму, що обумовило значний вплив протеїназ на розвиток органопатології. У цій ситуації застосування препаратів з антипротеазною активністю  змогло б заблокувати агресивну дію неспецифічних протеїназ і сприяти відновленню інгібіторного захисту органів, отже такий метод корекції є патогенетично обґрунтованим.

Результати проведених експериментальних досліджень показали, що при реперфузійному синдромі, обтяженому впливом іонізуючого випромінювання, спостерігається значна активація процесів вільнорадикального окиснення. Про це свідчить підвищення вмісту в сироватці крові ТБК‑активних продуктів, яке досягло 49,2 % (p<0,001) к 6-ій годині дослідження і практично не змінилося к 12-ій годині. При розвитку комбінованого радіаційно-реперфузійного ураження спостерігалося значне зниження активності СОД, яке к 6-тій годині дослідження досягнуло 34,5 % (p<0,001), а через 12 годин після реваскуляризації кінцівок складало 68,6 % (p<0,001) порівняно з показниками інтактних тварин. Відмічалося також падіння активності каталази на 22 % (p<0,05) к 6-ій годині дослідження, яке змінилося її недостовірним підвищенням на 23,3 % (Р>0,25) у порівнянні з контролем через 12 годин. Через 6 годин після зняття джгутів розвиток комбінованого ураження супроводжувався незначним і недостовірним зниженням ППА, а к 12-ій годині падіння цього показника складало 56,1 % (p<0,001) порівняно з контролем. Вміст основного антиоксиданту сироватки церулоплазміну при розвитку реперфузійного синдрому, обтяженого впливом іонізуючого випромінювання, через 6 годин після зняття джгутів знизився на 40,4 % (p<0,001), а через 12 годин – на 53,6 % (p<0,001) у порівнянні з контролем.

Таким чином, аналіз показників ліпопероксидації і системи антиоксидантного захисту дозволяє констатувати, що висока інтенсивність процесів ПОЛ, яка перевищує антиокислювальний потенціал організму, є важливою ланкою патогенезу реперфузійного синдрому, обтяженого впливом іонізуючого випромінювання. При цьому, висока інтенсивність процесів ПОЛ в ішемізованих тканинах з подальшим надходженням вільних радикалів і продуктів ліпопероксидації в системний кровообіг обтяжується процесами іонізації та радіолізу води, які є провідним джерелом активації вільнорадикальних процесів при променевій патології.

Динаміка біохімічних змін при розвитку реперфузійного синдрому в умовах впливу іонізуючого випромінювання супроводжувалася виразними патоморфологічними змінами у міокарді, легенях, нирках, печінці і слизовій оболонці тонкого кишечнику. При цьому в усіх тканинах, що вивчалися, спостерігались порушення мікроциркуляції, які характеризувалися повнокров'ям вен і артерій, судин мікроціркуляторного русла з розширенням їх просвітів та стоншенням стінок, явищами стазу та сладжу, а також дифузною геморагічною інфільтрацією та множинними петехіальними крововиливами. В міокарді відмічалися білкова дистрофія кардіоміоцитів, набухання їх цитоплазми, відсутність поперечного викреслення.  В альвеолах легень спостерігалися набрякова рідина, десквамовані альвеолоцити. У нирках виявлялися фібріноїдне набухання клубочків, десквамація епітелію проксимальних канальців, тубулорексис. У тканинах печінки спостерігалися ознаки жирової трансформації гепатоцитів на периферії часток. У препаратах слизової оболонки тонкого кишечнику відмічалися ерозії з відторгненням ворсин і оголенням власної пластинки епітелію.

Звертаючи увагу на провідну роль системного дисбалансу протеїназ-інгібіторної системи та інтенсифікації процесів ПОЛ у патогенезі реперфузійного синдрому в умовах впливу іонізуючого випромінювання, представляє інтерес вивчення ефективності поєднаного застосування антиоксидантних препаратів та інгібіторів протеїназ для патогенетичної корекції патології, що вивчається.