ДифФеренцИАЛЬнаЯ дИагностика ЭпИтелИальнЫх дисплазИй шЕйки матки И ИнтраЭпИтелИальноЙ карциномЫ

summary

Матеріали і методи дослідження. Дана робота ґрунтується на результатах комплексного морфологічного дослідження 110 зразків тканини ШМ з незміненим багатошаровим плоским епітелієм, з різними ступенями тяжкості епітеліальної дисплазії, CIS та invCa, отриманих при діагностичній біопсії і при хірургічних втручаннях, проведених у Харківській обласній клінічній лікарні за період 2004–2007р.р. У роботу також уключений ретроспективний аналіз частоти зустрічальності і факторів ризику розвитку плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ і РШМ, проведений на основі вивчення архівного біоптичного й операційного матеріалу патологоанатомічного відділення тієї ж лікувальної установи за період 2001–2005р.р., у процесі якого було виявлено 182 випадки дисплазій, CIS і РШМ.

Весь матеріал був розділений на 6 досліджуваних груп. I-у групу – незмінений багатошаровий плоский епітелій (НБПЕ ШМ) – представлено 20 зразками тканини ШМ з нормальною будовою епітелію, II-у – 16 зразками тканини ШМ з цервікальною інтраепітеліальною неоплазією I ступеня тяжкості (CIN I), III-ю – 15 зразками тканини ШМ з CIN II, IV-у – 17 зразками тканини ШМ з CIN III – важка дисплазія, V-у – 18 зразками тканини ШМ з CIN III – преінвазивна карцинома (CIS), VI-у групу представлено 24 зразками тканини ШМ з інвазивним плоскоклітинним раком (invCa).

Для діагностики уражень ШМ використовували критерії Гістологічної класифікації пухлин жіночої статевої системи, 2-а редакція (1994), у якій диспластичні зміни різних ступенів тяжкості і преінвазивна карцинома ШМ, відносно яких використовуються терміни цервікальна інтраепітеліальна неоплазія (CIN), плоскоклітинні інтраепітеліальні ураження (SIL), підрозділяють на слабкий (CIN I), помірний (CIN II) і важкий (CIN III) ступені. Останній включає і рак in situ (преінвазивна карцинома).

Матеріал фіксували в 10% розчині забуференого нейтрального формаліну, потім піддавали стандартній парафіновій проводці. З виготовлених таким чином блоків робили серійні зрізи завтовшки 4-5×10^-6м.

Морфологічна обробка включала комплекс гістологічних, гістохімічних, ІГХ і морфометричних методів. Препарати забарвлювали гематоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за методом ван Гізон та за методом Малорі для виявлення колагенових волокон.

У препаратах, забарвлених азотнокислим сріблом вивчали активність аргірофільних білків, що асоціюються з ділянкою ядерцевих організаторів (БДЯОр). PAS-реакцію використовували для виявлення глікогену і з'єднання білка з вуглеводами. Методом Браше оцінювали вміст РНП в цитоплазмі епітеліоцитів з контролем кристалічної рибонуклеази. Методом Фьольгена-Россенбека визначали вміст ДНП в ядрах з контролем реакцією гідролізу з HCl. Цитофотометричним методом визначали оптичну щільність вмісту РНП і ДНП в зеленій частині спектру на зрізах, оброблених даними гістохімічними методами. На препаратах, забарвлених методом Фьольгена-Россенбека, у всіх досліджуваних випадках також проводилася плоїдометрія.

У препаратах, забарвлених гематоксиліном і еозином, проводили комплекс морфометричних досліджень з вимірюванням товщини епітеліального пласта, товщину шару базальноклітинної гіперплазії, а також проводили цито- і каріометрію.

Імуноморфологічне дослідження проводили на парафінових зрізах, завтовшки 5-6мкм непрямим методом Кунса за методикою Brosman (1979). Апоптоз визначали з МКАТ до CD₉₅, а клітини, що продукують ендотелін-1, виявлялися МКАТ до ендотеліну-1 (Novocastra Laboratories Ltd, UK). Колаген типірували МКАТ до колагену I, III, IV типів. У якості люмінесцентної мітки використовували F(ab)-2-мічені фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші (FITS). Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 з використанням світлофільтрів: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. Інтенсивність світіння визначали на мікрофлюориметрі з ФЕУ-35 і виражали в умовних одиницях, рівних струму, що протікає через вимірювальний прилад, виражених у мікроамперах (А×10^-6).

Також проводили ІГХ реакції з МКАТ до білка проліферації Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation) і до онкопротеїну p16^INK4a (kit для гістологічних препаратів (hystological) №К5334, DakoCytomation). Клітини, позитивні відносно експресії маркерів, вивчали в 4-6 випадково вибраних полях зору. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих об'єктів (ядер або клітин), обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок. Як позитивну вважали реакцію в нормальних клітинах епітеліального шару, а також диспластично і неопластично змінених (О.В. Дорохова, 2007; С.В. Петров, Н.Т. Райхлин, 2004; T. Sano et al., 1998).

Комплекс гістологічних, морфометричних, стереометричних і цитофотометричних досліджень проводився на мікроскопі Olympus BX-41 з використанням програм Olympus DP-Soft (Version 3:1) і Microsoft Excel (С.Н. Лапач с соавт., 2001).

Весь цифровий масив даних оброблявся методами математичної статистики з використанням варіаційного, альтернативного і кореляційного аналізів. При використанні методів альтернативної і варіаційної статистики обчислювали середню арифметичну, середнє квадратичне відхилення, середню помилку різниці, імовірність різниці. Імовірність різниці між двома середніми при малих вибірках визначали за таблицею Ст'юдента з дотриманням умови (n1+n2–2). При визначенні ступеня ймовірності припускали точність р≤0,05. Оцінку взаємозв'язків окремих параметрів у досліджуваних групах проводили методом кореляційного аналізу (Г.Ф. Лакин, 1990; В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева, 2000).

Результати дослідження та їх обговорення. При аналізі розподілу пацієнток з плоскоклітинними інтраепітеліальними ураженнями ШМ за віком виявлено, що пік захворюваності припадає на вік 50-59 років, за яким за частотою зустрічальності плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ іде група 40-49 років. Вікові групи 40-49 і 50-59 років – це групи, де найчастіше зустрічаються поліпи ШМ і ще достатньо велика кількість ендоцервікозів, а також найчастіше зустрічаються проліферативні процеси міометрію та ендометрію, що, можливо, пов'язано з гормональними змінами в організмі жінок, які обумовлені періодами клімаксу і менопаузи.

Середній вік пацієнток з передраковими процесами та CIS складає 45,5±3,6 років, а саме: CIN I – 44,1±5,7 роки, CIN II – 47,5±6,4 років, CIN III – 43,4±6,8 роки, CIN III з осередками CIS та ізольованою CIS – 47,1±7,6 років. InvCa найчастіше спостерігається в групі 40-49 років, але середній вік пацієнток складає 52,8±6,6 роки, що досягається за рахунок також достатньо високої частоти зустрічальності в наступних вікових категоріях.

З фонових процесів перше місце за ризиком виникнення плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ посідає ендоцервікоз з епідермізацією, що найчастіше зустрічається у віці 20-29 років і майже рівномірно зменшується у міру збільшення віку, друге місце – поліпи ШМ з явищами епідермізації, які найчастіше зустрічаються в групах 40-49 і 50-59 років.

У міру розвитку диспластичних станів методом морфометрії установлено збільшення середніх значень товщини епітеліального пласта, товщини шару анапластичних змін і, відповідно, співвідношення товщини епітеліального пласта і його нижніх шарів, а також діаметру й об'єму ядер і клітин вищеназваних шарів у міру збільшення тяжкості стадій канцерогенезу ШМ (табл. 1).

Значно помітним виявилося збільшення середніх значень діаметру й об'єму ядер у групах з помірним і важким ступенями плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ. Разом з тим відзначено, що ці показники при CIS по відношенню до важкої дисплазії і при invCa по відношенню до CIS збільшилися незначно. Відповідно змінам розмірів ядер і клітин у міру збільшення тяжкості ступеня плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ змінюється і об'єм цитоплазми – зменшується, унаслідок чого з тією ж закономірністю збільшується ЯЦІ.