РОЛЬ МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ ADAM8 У ПАТОГЕНЕЗІ РАКУ ПІДШЛУНКОВОЇ ЗАЛОЗИ : РОЛЬ металлопротеиназ ADAM8 В ПАТОГЕНЕЗЕ рака поджелудочной железы

summary

Матеріали та методи дослідження. Клітинні лінії Aspc-1, Panc-1, BxPC-3, Capan-1 та MiaPaCa-2 були отримані з Американської колекції культур клітин (American Type Culture Collection) (Роквіль, США). Клітинні лінії Cоlo-357, Su8686 та T3M4 були люб`язно надані Prof. R.S. Metzgar (Університет Дюка, Дурхем, США). Лінії клітин культивували у поживному середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% FBS, 100 од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину (Invitrоgen, Карлсрує, Німеччина) та інкубували при 37˚С з 5% CO₂.

Зразки пухлинної тканини (n=99) були отримані від хворих на ПАПЗ, а тканина ПЗ при ХП - від хворих на ХП (n=36). Тканина нормальної ПЗ (n=28) була одержана згідно програми трасплантації органів від здорових донорів. Всі зразки тканини хворих підлягали гістологічному дослідженню, після чого було отримано гістологічне підтвердження діагнозу.

В роботі були використані зразки сироватки крові 28 хворих на РПЗ (середній вік 63 роки) та 28 пацієнтів з діагнозом ХП (середній вік 50 років), які лікувалися у хірургічному відділені Хейдельберзького Університету (Німеччина). 28 зразків сироватки були одержані від здорових волонтерів (середній вік 35 років). Програма досліджень була схвалена комісією з біоетики Університету Карла Рупрехта м. Хейдельберг. Усі пацієнти були попереджені про дослідження та дали свою поінформовану згоду на участь у їх проведенні.

Визначення експресії ADAM8 на рівні мРНК проводилось методом кількісної ПЛР у реальному часі у 8 лініях клітин РПЗ: Aspc-1, BxPC-3, Capan-1, Cоlo-357, Panc-1, MiaPaCa-2, Su-8686 та T3M4. Дослідження рівня експресії білка ADAM8 в цих клітинних лініях проводили методом Вестерн-блот аналізу. Для встановлення впливу гіпоксії на експресію ADAM8 на рівні мРНК та на рівні білка, клітинні лінії РПЗ культивували протягом 24 годин в умовах гіпоксії (у гіпоксичній камері), після чого негайно виділяли РНК та одержували екстракти білків для подальшого дослідження та проведення порівняльного аналізу з відповідними клітинними лініями за нормальних умов культивування.

Визначення вмісту мембранних та розчинних форм білка АDАМ8, методом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), було проведено в лізатах та супернатантах 8 ліній клітин РПЗ.

Для проведення трансфекції siRNA АDАМ8 нами була відібрана клітинна лінія РПЗ, Aspc-1, у якій було виявлено найвищий рівень експресії АDАМ8. З метою встановлення часу максимального пригнічення експресії АDАМ8, ми визначали експресію АDАМ8 на рівні мРНК та на рівні білка через 48, 72 та 96 годин після трансфекції siRNA АDАМ8 у порівнянні з експресією АDАМ8 на рівні мРНК та на рівні білка у клітинах відповідної вихідної лінії, що були трансфіковані  контрольною (неспецифічною) siRNA.

Вплив білка АDАМ8 на проліферативний потенціал клітин РПЗ вивчали на моделі лінії клітин Аspc-1, трансфікованої siRNA ADAM8, із застосуванням МТТ тесту.

Для визначення впливу білка ADAM8 на інвазивний потенціал клітин РПЗ, після проведення трансфекції siRNA ADAM8 у клітини лінії Аspc-1, використали Invasion assay метод. Клітини були поміщені у інвазивну камеру та, після 24 годин інкубації, клітини, що проявили інвазивну здатність, підраховували у світловому мікроскопі. Інвазивний індекс вираховували як різницю між кількістю клітин, що проявили інвазивну активність, після проведення трансфекції siRNA АDАМ8, та кількістю клітин, з інвазивною активністю, контролю.

Для проведення аналізу повного профілю білків у супернатантах клітин лінії Aspc-1, трансфікованих siRNA ADAM8, у порівнянні з супернатантами клітин, що були трансфіковані контрольною (неспецифічною) siRNA, була використана мас-спектрометрія, а саме SELDI-TOF-MS-аналіз.

Для порівняння експресії ADAM8 на рівні мРНК та білка були використані зразки пухлинної тканини 67 хворих на ПАПЗ, тканини ПЗ 28 хворих на ХП та 20 донорів. Середній вік хворих на ПАПЗ становив 62 роки, при цьому мінімальний вік хворих становив 38 років та максимальний - 78 років. Визначення експресії ADAM8 на рівні мРНК проводили методом кількісної ПЛР в реальному часі. Білок ADAM8 визначали методом Вестерн-блот аналізу. 

Для з`ясування можливості використання рівня розчинних форм АDАМ8 у якості сироваткового маркера для хворих на ПАПЗ та ХП, було проведено визначення рівня білка АDАМ8 у сироватці крові 28 хворих на РПЗ (середній вік - 63 роки), 28 хворих на ХП (середній вік - 50 років) та 28 здорових волонтерів (середній вік - 35 років). Визначення вмісту білка АDАМ8 в сироватці крові було здійснено за допомогою методу твердофазного імуноферментного аналізу (ELISА).

Імуногістохімічне дослідження проводили для виявлення рівня експресії білка ADAM8 (за інтенсивністю забарвлення) та його локалізації у зрізах тканини ПАПЗ 99 хворих, зрізах тканини ПЗ 7 хворих на ХП, зрізах тканини ПЗ 8 донорів та у зрізах тканини лімфатичних вузлів 6 хворих на ПАПЗ при наявності в цих лімфатичних вузлах метастазів. Експресію ADAM8 визначали імунопероксидазним методом з використанням специфічних до цитоплазматичного домена білка ADAM8 кролячих поліклональних антитіл (Chemicon Inte ational, Темекула, США) та системи візуалізації En Vision (DAKO Cytomation, Гамбург, Німеччина).

Отримані результати були оброблені відповідними статистичними методами. Виживаність хворих визначали методом Каплан-Мейєра, різницю між кривими виживаності аналізували за допомогою log-rank критерію. Кореляційні зв´язки оцінювали шляхом розрахунку коефіцієнтів Пірсона [r], Спірмана [rho] та критерія χ². Різницю між показниками оцінювали за допомогою критерія Манна-Уітні. Достовірними вважалися данні з P<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. У попередніх роботах було встановлено кореляцію експресії білка ADAM8 з прогресією пухлинного процесу при раку легені та передміхурової залози (Ishikawa N. et al., 2004, Fritzsche F. R. et al., 2006).

Нами були проведені дослідження на клітинних лініях РПЗ людини, а саме BxPc-3, Panc-1 та MiaPaCa-2, які походять з клітин РПЗ (ступінь диференціювання G3), Aspc-1 – з пухлинних клітин, які виділені з асцитної рідини хворого на РПЗ (G2), Su-8686 та Capan-1 – з клітин метастазів РПЗ у печінку (Su-8686 - G2/3, Capan-1 - G1) та T3M4 – з метастазів РПЗ у лімфатичні вузли (G2) та Colo-357.