МЕХАНІЗМИ ІМУНОТРОПНОЇ ДІЇ ТРАНКВІЛІЗАТОРІВ БЕНЗДІАЗЕПІНОВОГО РЯДУ В УМОВАХ ХРОНІЧНОГО СТРЕСУ : МЕХАНИЗМЫ иммунотропные ДЕЙСТВИЯ транквилизаторы бенздиазепиновых РЯДА В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА

summary

Матеріали і методи досліджень.  Дослідження проведені на 386 безпородних щурах-самцях масою 180-200 г та 166 мишах лінії CBA масою 18-22 г, які утримувались в стандартних умовах віварію ОДМУ. Тварини були поділені на наступні групи: 1 – інтактні тварини; 2, 3, 4 і 5-а групи - тварини, які зазнали хронічного стресу відповідно протягом 1, 2, 3 та 4 діб; 6, 7, 8 і 9-у групу становили тварини, яких досліджували відповідно через 1, 3, 7 та 14 діб після закінчення експозиції стресу; наступні групи становили тварини, які протягом 4 діб відтворення стресу профілактично отримували відповідно реланіум ("Gedeon Richter", Угорщина) дозою 2 мг/кг, внутрішньоочеревинно (в/о); гідазепам («ІнтерХім», Україна) - 10 мг/кг в/о; циназепам – діюча речовина (ФХІ ім. О.В.Богатського НАН України) 10 мг/кг в/о. У якості моделі хронічного стресу був обраний метод депривації парадоксального сну (ДПС) протягом 4 діб за методом D.Jouvet et al (1964). Після закінчення експерименту тварин декапітували під ефірним наркозом. Досліди проводили відповідно до вимог GLP, методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України [Стефанов О.В., 2001] та комісії з біоетики ОДМУ (протокол № 70А від 23.05.2008 р.).

Лімфоцити з периферичної крові видаляли за методом A.Boyum (1968). Проліферативна активність лімфоцитів периферичної крові оцінювалась за результатами внутрішньошкірної (в/ш) проби з конканаваліном А (Кон А) (розведення 50 г/мл, 0,1 мл у вухо щурів). Реакцію оцінювали через 48 год порівняльним зважуванням вуха з утвореним інфільтратом і контрлатерального вуха. За процентом збільшення ваги оцінювали мітогенний вплив Кон А.

Оцінку гуморальної імунної відповіді проводили через 5 діб після імунізації мишей еритроцитами барана в дозі 0,2 млрд  клітин в/о на 0,2 мл фізіологічного розчину шляхом підрахунку кількості антитілутворюючих клітин (АУК) селезінки та титрів загальних антитіл (АТ) в крові. Титри АТ в сироватці крові визначали методом прямої гемаглютинації, а кількість АУК в селезінці – методом локального гемолізу в гелі агарози [Je e K.N., Nordin A.A., 1963].

Стан клітинної ланки противірусної резистентності організму оцінювали за цитолітичною активністю К-клітин крові. У якості клітин-мішеней використовували еритроцити барана, оброблені антисироваткою різного розведення. Стан гуморальної ланки противірусного імунітету оцінювали за інтенсивністю вірусіндукованого інтерфероноутворення, яке моделювали шляхом інтраназального зараження тварин сублетальною дозою патогенного штаму вірусу грипу А 3,5 lg LД₅₀ (0,2 мл). Рівень a-інтерферону в сироватці крові визначали через 2, 4 і 7 діб після інфікування шляхом титрування його противірусної активності [Гончаров А.Г. и соавт., 1997].

Резидентні макрофаги змивали з перитонеальної порожнини декапітованих мишей 5 мл середовища 199 з 100 ОД/мл бензилпеніціліну-натрія («Київмедпрепарат», Україна). Для індукції утворення ЛАФ використовували Staphylococcus aureus у розрахунку 20-30 вбитих нагріванням мікробних тіл на 1 фагоцит. ЛАФ-активність інкубатів мононуклеарних фагоцитів оцінювали за їх здатністю викликати комітогенний вплив на проліферацію тимоцитів, стимульованих субоптимальними дозами лектинів [Rosenwasser L.J., Dinarello C.A., 1981]. За одиницю активності ЛАФ приймали таку його концентрацію (в мл), яка підсилювала проліферацію тимоцитів на 50 % відносно її максимальної стимуляції, яка викликається субоптимальною дозою лектину. Для проведення РБТЛ периферичної крові щурів клітини культивували з Кон А (0,75 мкг/мл) і нативним препаратом інтерлейкін-1b (ІЛ-1в) кроля в дозі 0,06 мкг/мл. Радіоактивність зразків вимірювали за допомогою в-лічильника (LKB).

Вміст цАМФ і цГМФ визначали за допомогою наборів фірми Amercham (UK). Для визначення цАМФ використовували – [¹²⁵I] RIA KIT Code:R¹⁰¹²; для цГМФ - [¹²⁵I] RIA KIT Code:R¹⁰⁴². Радіоактивність зразків вимірювали на в-лічильнику (LKB). Розмірність концентрації – пмоль/10⁶ лімфоцитів.

Вміст малонового діальдегіду (МДА) в гомогенаті органів імуногенезу визначали методом І.Д.Стальної, Т.Г.Гарішвілі (1977); дієнових кон’югатів (ДК) – методом В.А.Костюк і спів. (1984), активність супероксиддисмутази (СОД) – методом О.П.Макаревич, П.П.Голікова (1983), каталазну активність – методом М.А.Королюк і спів. (1988), вміст б-токоферолу – методом Р.Ш.Киселевич, С.И.Скварко (1972). В ліпідних екстрактах лімфоцитів визначали вміст загального холестерину (ХС), фосфоліпідів (ФЛ) та вираховували їх молярне співвідношення. Фракціонування ФЛ проводили методом тонкошарової хроматографії і ідентифікували за відомими значеннями R_f. Вміст індивідуальних фракцій - лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СФМ), фосфатидилхоліну (ФХ), кардіоліпіну (КЛ) і фосфатидилетаноламіну (ФЕА) оцінювали за кількістю ліпідного фосфору [Зубер В.Л., 1982]. В лімфоцитах органів імуногенезу вивчали активність аденозиндезамінази (АДА) [Дмитренко Н.М. і спів., 1980] і 5’-нуклеотидази (5’-НК) [Рыбальченко В.К., Коганов М.М, 1988].

Статистичну обробку результатів досліджень здійснювали за допомогою критерія Ст’юдента, коефіцієнта кореляції та пакету програм Microsoft Word, Microsoft  Excel, Microsoft  Graph 5.0  згідно останніх вимог щодо статистичної обробки медичної інформації [Лапач С.Н. i спів., 2001].

Результати дослідження. Стан імунологічної резистентності організму в умовах стресу і його фармакологічної корекції оцінювали за інтегральними показниками гуморального імунітету, противірусної резистентності та проліферативної активності лімфоцитів в тесті з в/ш уведенням Кон А.

Встановлено, що зміна інтегральних показників гуморального імунітету в умовах хронічного стресу має фазний характер. Найбільш глибокі патологічні зрушення спостерігаються під час стадії виснаження стресу і полягають у зменшенні відповідно на 72,6 % (Р<0,05) і 62,0 % (Р<0,05) вмісту АУК селезінки і титрів АТ після імунізації тварин еритроцитами барана. Профілактичне введення реланіуму недостовірно зменшувало депресію імунної відповіді під час стадії виснаження стресу, проте гальмувало її реабілітацію у післястресовому періоді, пролонгуючи цей термін порівняно з нелікованими тваринами з 7 до 14 діб. Гідазепам і циназепам за аналогічних умов утримували вміст АУК на рівні, який відповідно у 2,3 (Р<0,05) і 1,3 (Р<0,05) рази, та титри АТ – у 2,0  (Р<0,05)  та 1,5 (Р<0,05) рази перевищував аналогічні показники в умовах стресу без корекції. При цьому гідазепам в умовах стресу пролонгував період резистентності стресу та більш ніж удвічі (з 7 до 3 діб) скорочував термін післястресової реабілітації гуморального імунітету.