РОЛЬ ТКАНЕВЫХ БАЗОФИЛОВ В КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЯХ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ : РОЛЬ ТКАНИННИХ БАЗОФІЛІВ У КЛІТИННИХ РЕАКЦІЯХ ПРИ ХРОНІЧНОМУ ЗАПАЛЕННІ

summary

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на 144 щурах-самцях лінії Wistar масою 180–200 г, розведених у віварії Харківського національного медичного університету. Дослідних тварин тримали на звичайному харчовому раціоні з вільним доступом до води по 6 особин в стандартних металевих клітках. Для виключення впливу сезонних і добових коливань на показники, що вивчаються, основні дослідження були проведені в осінньо-зимовий період, у ранкові години. Досліди здійснювали відповідно до національних «Загальних етичних принципів дослідів на тваринах» (Україна, 2001), які узгоджуються з положеннями «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою» (Страс­бург, 18.03.86). Тварин декапітували під ефірним наркозом. Усі хворобливі і стресові процедури здійснювали під легкою ефірною анестезією. Використо­вували мінімально допустиму для статистичної обробки та одержання достовірних результатів загальноприйняту кількість тварин (по 6 на групу), а також мінімально достатню для досягнення мети і вирішення завдань дослідження кількість експериментальних груп, тобто загальну кількість тварин (протокол комісії з біоетики від 01.10.08).

Як матеріал для досліджень використовували тканини вогнища запалення, кістковий мозок стегна, периферичну кров.

Моделлю запалення було карагіненове асептичне гранульоматозне запалення, викликане за принципом попереднього створення підшкірного «повітряного мішка». Для цього підшкірно вводили в підлопаткову ділянку 12 мл стерильного повітря. Через 24 год в сформований «повітряний мішок» вводили 2 мл 0,5%-ного розчину λ-карагінену (Sigma, США) на ізотонічному розчині хлориду натрію (Qing Jiang, Blount Ben C., Ames B.N., 2003). У до­кладній динаміці запалення з 6-ї години і до 28-ї доби досліджували клітинно-тканинну динаміку вогнища, морфофункціональний стан ТБ, кістковомозкове кровотворення, лейкоцитарну реакцію (включаючи функціональну активність лейкоцитів) периферичної крові.

Дослідження клітинно-тканинної динаміки вогнища запалення. У виведе­них з експерименту тварин забирали фрагменти шкіри з гіподермою і м'якими тканинами у вогнищі запалення. Одержаний матеріал фіксували в 10%-ному водному розчині нейтрального формаліну. Після закінчення спир­тової проводки матеріал піддавали парафіновій проводці, після чого виготов­ляли серійні зрізи завтовшки (4–5) х 10^-6 м. Оглядові препарати, забарвлені гематоксиліном та еозином, використовували для загальної оцінки стану досліджуваних тканин і морфометричного дослідження. Забарвлення препара­тів фукселеном на еластичні волокна за Вейгертом з дозабарвленням пікрофуксином за методом ван Гізон використовували для виявлення і диференціювання сполучнотканинних структур. Нейтральні мукополісахариди визначали ШИК-реакцією за Мак-Манусом–Хочкісом, кислі – шляхом забарвлення толуїдиновим синім при різних значеннях рН з контрольною обробкою зрізів гіалуронідазою. Для оцінки функціональної активності структурних компонентів використовували гістохімічну реакцію за методом Браше (контроль з кристалічною рибонуклеазою).

Вивчення мікропрепаратів проводили на мікроскопі «Olympus» BX-41 (Японія) з подальшим мікроскопічним фотографуванням.

Кількісну морфометричну оцінку клітинного складу запального інфільт­рата проводили за допомогою комп'ютерного цитоаналізатора «Olympus», окуляр-мікрометра АМ9-2 і сітки Автанділова при збільшенні у 400 разів. Визначали кількість різних клітинних елементів запального інфільтрату: нейтрофілів, еозинофілів, лімфоцитів, макрофагів, фібробластів, фіброцитів, плазматичних клітин, епітеліоїдних клітин.

Дослідження морфофункціонального стану тканинних базофілів. Гістологічні зрізи забарвлювали толуїдиновим синім і підраховували кількість ТБ в 100 полях зору мікроскопа при збільшенні у 400 разів, з них – кількість дегранульованих з розподілом за ступенем дегрануляції (Клименко Н.А., Татарко С.В., 1997).

Кістковомозкове кровотворення вивчали шляхом підрахунку загальної кількості каріоцитів (ЗКК) і клітинного складу кісткового мозку.

Для отримання кісткового мозку виділяли стегнову кістку щура, очищали її від м'яких тканин і ретельно промивали канал 1 мл 3%-ної оцтової кислоти (підфарбованої генціанвіолетом). Кістковий мозок суспендували, набирали в меланжер для білої крові і розводили 3%-ною оцтовою кислотою. Підрахунок ЗКК на стегно здійснювали за допомогою камери Горяєва.

Клітинний склад кісткового мозку досліджували шляхом підрахунку мієлограм в мазках кісткового мозку із стегнової кістки з подальшим перерахунком на абсолютну кількість клітин на підставі ЗКК. Для виготовлення мазків кісткового мозку його видавлювали з дистального кінця стегнової кістки на знежирене скло і розводили ізологічною сироваткою. Мазки фіксували в метанолі і забарвлювали азуром II – еозином за методом Романовського–Гімза.

Лейкоцитарну реакцію периферичної крові визначали шляхом підрахунку загальної кількості лейкоцитів (ЗКЛ) в крові, лейкоцитарної формули і дослідження функціонального стану лейкоцитів. ЗКЛ підраховували за допомогою камери Горяєва. Для визначення лейкоцитарної формули мазки крові фіксували в метанолі і забарвлювали азуром II – еозином. Підраховували лейкоцитарну формулу з подальшим перерахунком на абсолютну кількість клітин на підставі ЗКЛ.

Функціональний стан лейкоцитів крові встановлювали за активністю їх маркерних ферментів. Маркерами функціональної активності нейтрофілів були мієлопероксидаза (МПО) / К.Ф. 11.1.7/ і кисла фосфатаза (КФ) / К.Ф. 3.1.3.2/, моноцитів-макрофагів – α-нафтилацетатестераза (α-НАЕ), лімфоцитів – КФ і
α-НАЕ, які визначали цитохімічними методами Грехема–Кнолля, Берстона і Леффлера відповідно і виражали в середніх цитохімічних коефіцієнтах (СЦК), за винятком активності α-НАЕ у лімфоцитах, яку виражали у відносній кількості клітин, що містять α-НАЕ (Меньшиков В.В.).

Локальне видалення тканинних базофілів. Для місцевого попереднього видалення ТБ з вогнища запалення площу 2×2 см інфільтрували підшкірним введенням 1 мл розчину 48/80, що містить 300 мкг речовини, на ізотонічному розчині NaCl. Запалення викликали через 12 год введенням карагінену в це саме місце (Egger Y., Macheiner U., 1987).

Системне видалення тканинних базофілів. З метою попереднього видалення ТБ з організму внутрішньочеревно вводили 0,1%-ний розчин речовини 48/80 в ізотонічному розчині NaCl 8 разів по 2 рази на день починаючи з вечірньої дози: для перших шести ін'єкцій – 0,6 мг/кг, для останніх двох – 1,2 мг/кг. Запалення викликали через 6 год після останньої ін'єкції (Di Rosa M., Giroud J.P., Willoughby D.A., 1971).

Метод статистичної обробки результатів. Статистичну обробку результатів дослідження проводили з використанням комп'ютерної програми Stadia-6.0 і t-критерію Стьюдента на ПЕОМ «Pentium-3», а також за допомогою пакетів прикладних програм «Excel» для ПЕОМ, S-Plus 2000 (Кулаичев А.П., 1999).

Результати дослідження та їх обговорення. Перш за все було вивчено закономірності морфофункціонального стану ТБ вогнища хронічного запалення в докладній динаміці починаючи з 6-ї години і до 28-ї доби. Показано, що ТБ дійсно залучаються до патогенезу хронічного запалення, про що свідчать зміни їх кількості і посилення дегрануляції. При цьому реакція ТБ є фазною, при­наймні, двофазною протягом дослідженого періоду запалення. Перша фаза – короткочасна, інтенсивніша – спостерігається услід за відтворенням запалення протягом однієї доби і характеризується вираженою дегрануляцією ТБ і зниженням їх кількості. Пік її в нашому дослідженні відмічений на 6-й годині. Друга фаза – менш інтенсивна, тривала, «постійна» (без вираженого піку) –характеризується повторним помірним посиленням дегрануляції ТБ одночасно зі збільшенням їх кількості і спостерігалася з 14-ї до 28-ї доби. На 3-тю–7-му добу відмічався перехідний період, що характеризується зниженням дегрануляції ТБ відносно такої у першу фазу, яка залишається посиленою відносно вихідної, і початком відновлення кількості ТБ.

Перша фаза реакції ТБ пов'язана, очевидно, з початком хронічного запалення, яке спочатку завжди інтенсивніше, «гостріше», ніж надалі, друга – більше відображає морфофункціональний стан ТБ, характерний для хронічного запалення, що сформувалося, і спрямована, мабуть, на постійне, тривале, посилене, але помірне порівняно з гострим запаленням і першою фазою вивільнення біологічно активних речовин (БАР) ТБ у вогнищі хронічного запалення. Слід відмітити, що подальше збільшення кількості ТБ у вогнищі хронічного запалення порівняно з початковим багато в чому може бути взаємопов'язане з надмірним розростанням сполучної тканини, характерним для запалення, обов'язковим елементом якої є ТБ.

Як відомо з досліджень гострого запалення, ТБ відіграють дуалістичну роль у патогенезі запалення, викликаючи поряд із прозапальними судинно-ексудативними ефектами протизапальні клітинні. Тучноклітинні продукти, особливо гістамін і серотонін, є одними з основних медіаторів негайної фази підвищення проникності судин вогнища запалення. Через лейкоцити ТБ беруть участь у регуляції проникності судин в уповільненій фазі її підвищення (Липшиц Р.У., Клименко Н.А., 1977; Клименко М.О., Татарко С. В., 1992; Клименко М.О., Павлова О.О., 1997). Виявлено модулюючий вплив ТБ на інфільтративні та репаративні явища при запаленні. ТБ пригнічують нейтро­філи і стимулюють моноцити та фібробласти, і в механізмах цього впливу мають значення головним чином гістамін, серотонін і гепарин; при цьому гістамін діє на нейтрофіли в основному через Н₂-рецептори, на моноцити – через Н₁-рецептори, на фібробласти – через H₁ і Н₂-рецептори (Клименко Н.А., Пишнов Г.Ю., 1993, 1997; Клименко Н.А., Татарко С.В., 1995). ТБ також стимулюють еозинофіли і можуть активувати лімфоцити (через H₁-рецептори) або пригнічувати їх (через Н₂-рецептори) (Гольдберг Е.Д,, Дыгай А.М., Клименко Н.А. и др., 1993; Клименко Н.А., Шутова Н.А., 2007). Крім того, лейкоцити чинять на ТБ регулюючий вплив, у механізмах якого відіграють роль лізосомальні ферменти, активні форми кисню, циклооксигеназні і ліпооксигеназні ейкозаноїди (Клименко Н.А., Козырева Г.Ф., 2001–2002). ТБ і лейкоцити взаємодіють у регуляції запальних явищ (Клименко Н.А., 1992).

Зі сказаного витікає, що ТБ, мабуть, мають істотне значення у патогенезі хронічного запалення і, можливо, посилюють функціональну активність «клітин хронічного запалення»: макрофагів, лімфоцитів, фібробластів, еозинофілів  – і гальмують активність основних ефекторів гострого запалення – нейтрофілів.

Подальшим етапом дослідження стало з'ясування безпосередньо ролі ТБ у патогенезі хронічного запалення, а саме: в клітинно-тканинних реакціях вогнища хронічного запалення і системи крові в цілому. Як було зазначено, система крові є основною ефекторною системою запалення; лейкоцити є основними клітинними ефекторами запалення; клітинно-тканинна динаміка вогнища запалення і взаємопов'язані з нею зміни в системі крові є основним параметром наявності, перебігу, етапу запалення, ефективності протизапальних засобів і відповідної терапії (Альперн Д.Е., 1959; Чернух А.М., 1979; Маян­ский Д.Н., 1991; Клименко Н.А., 1997).

Виявлено, що при хронічному запаленні, викликаному на тлі попереднього локального видалення ТБ, відбувається зменшення судинних реакцій у вогнищі, запального набряку, еміграції нейтрофілів і моноцитів, накопичення й активності макрофагів, більш рання епітеліолізація макрофагів, зниження активації фібробластів, ангіогенезу та утворення грануляційної тканини, тобто зниження вираженості судинно-ексудативно-інфільтративних та репаративних явищ, послаблення інтенсивності запалення. Одержані резуль­тати свідчать про те, що за природних умов хронічного запалення ТБ, навпаки, стимулюють ці явища і, очевидно, посилюють «гостроту» і завершеність запалення, тобто його захисно-пристосувальні властивості, і, таким чином, протидіють швидкій хронізації процесу. Водночас при видаленні ТБ збільшується акумуляція й активація лімфоцитів, можливо, забезпечуючи та відображаючи посилений розвиток хронічного запалення. Результати свідчать про те, що за природних умов хронічного запалення ТБ стримують лімфо­цитарну реакцію і, як наслідок, надмірну активацію макрофагів і фібробластів лімфоцитами та прогресування процесу.

Як було зазначено, при гострому запаленні ТБ обмежують еміграцію нейтрофілів у вогнище, стримуючи надмірні альтеративні явища, при хронічному ж – підвищують, мабуть, з метою посилення боротьби з флогоге­ном і зниженням у такий спосіб хронізації. Макрофагальну і фібробластичну реакції ТБ посилюють також при гострому і, як видно, при хронічному запа­ленні, очевидно, для підвищення ефективності ранового очищення вогнища і проліферації. Інша річ, що при хронічному запаленні, зважаючи на немож­ливість повної елімінації флогогену, макрофаги перетворюються на самостій­ний патогенний чинник, який підтримує, а не завершує запалення, а проліфе­рація виявляється неефективною (Чернух A.M., 1979; Маянский Д.Н., 1991).

Як відомо, при гострому запаленні лімфоцитарна реакція не виражена, у цьому немає необхідності, оскільки це оптимальний перебіг запалення, і ТБ можуть пригнічувати лімфоцити через Н₂-рецептори; при хронічному процесі лімфоцити разом з макрофагами стають одними з основних ефекторів процесу, а при хронічному запаленні на тлі видалення ТБ залучення лімфоцитів ще більше, можливо, у зв'язку з посиленою хронізацією процесу. Крім того, збільшена лімфоцитарно-плазматична реакція може відображати напругу в імунній системі у зв'язку з порушенням звичайної клітинної динаміки вогнища запалення, зважаючи на регуляторну роль лімфоцитів щодо решти запальних клітин, тобто бути компенсаторною.

У свою чергу, зазначена різниця в нейтрофільній реакції при гострому і хронічному запаленні, мабуть, філогенетично детермінована (а визначається у кожному конкретному випадку етіологією запалення і реактивністю організму) різницею в експресії рецепторів на нейтрофілах. Як вже відмічалося, основний тучноклітинний продукт гістамін стимулює запальні клітини через H₁-рецепто­ри, а пригнічує через Н₂-рецептори. Водночас відомо, що при гострому запаленні на нейтрофілах виражена експресія Н₂-рецепторів, а на моноцитах-макрофагах, фібробластах та ендотеліоцитах – H₁-рецепторів (Маянский Д.Н., 1991; Дыгай A.M., Клименко Н.А., 1992). Можливо, розвиток хронічного запалення філогенетично взаємно детермінований зі зміною експресії і (або) чутливості рецепторів на клітинах. Очевидно, зі зниженням гостроти процесу зменшується експресія і (або) чутливість зазначених рецепторів на запальних клітинах. Так, при карагіненовому гострому запаленні, яке в цілому є менш інтенсивним, ніж гостре інфекційне, ТБ не обмежують акумуляцію нейтрофілів у вогнищі, а дещо посилюють її, а акумуляцію моноцитів-макрофагів вони стимулюють менше (Клименко Н.А., Шутова Н.А., 2007). Між тим філогене­тично детермінованою, очевидно, є також відмінність у реакції ТБ при гостро­му і хронічному запаленні, а відповідно, і в кількостях та співвідношеннях їх продуктів: нейтрофільних хемотаксичних факторів, гістаміну, ейкозаноїдів тощо, кожен з яких у свій спосіб впливає на нейтрофіли та інші клітини. Це підтверджується різницею в закономірностях змін кількості і дегрануляції ТБ при гострому й хронічному запаленні. При гострому запаленні ТБ також реагують фазно; при цьому перша фаза скорочується до 30 хв після дії запаль­ного агента і характеризується інтенсивною масовою дегрануляцією клітин та швидким різким зниженням їх кількості (аж до повного зникнення при дії сильного подразнювального флогогену, здатного не просто активувати, а й ушкоджувати ТБ); друга фаза спостерігається після 1-ї години від початку запа­лення і характеризується деяким відновленням кількості ТБ одночасно з їх достатньо вираженою дегрануляцією, вона досягає піку на 6-ту годину запален­ня і триває щонайменше протягом 10 діб; при цьому початкова кількість ТБ у вогнищі відновлюється лише до 90-ї доби, а регрануляція ТБ може не завер­шуватися і до 120-ї доби (Липшиц Р.У., Клименко Н.А., 1977; Клименко Н.А., Татарко С.В., 1992, 1995; Клименко М.О., Павлова О.О., 1997). Це свідчить про те, що досить швидке відновлення кількості ТБ і навіть перевищення їх початкової кількості є особливістю саме хронічного запалення і багато в чому може бути пов'язано з розростанням сполучної тканини.

При вивченні кістковомозкового кровотворення і лейкоцитарної реакції периферичної крові виявлено, що при хронічному запаленні на тлі попередньо­го локального видалення ТБ з вогнища відбувається посилення гемопоезу, особливо лімфопоезу, і зменшення надходження лейкоцитів з кісткового мозку в кров. Результати свідчать про те, що за природних умов хронічного запалення ТБ обмежують гемопоез, особливо лімфопоез, і посилюють вихід каріоцитів з кісткового мозку в кров.

Стримування гемопоезу ТБ при хронічному запаленні є, мабуть, одним з механізмів попередження швидкого прогресування хронічного запалення. Його механізм полягає, можливо, в зниженні продукції лейкоцитами гемопоетичних чинників під безпосереднім впливом БАР ТБ (Дыгай A.M., Клименко Н.А., 1992). Незважаючи на те що ТБ стимулюють моноцити-макрофаги, основні продуценти лейкопоетинів (колонієстимулюючих чинників), при хронічному запаленні значно змінюється функціональний стан і роль самих макрофагів порівняно з гострим запаленням. Ще один, опосередкований, механізм може полягати в гальмуванні ТБ лімфоцитів і, отже, їх хомінгу з крові в кістковий мозок, де вони ініціюють процеси проліферації та диференціювання клітин-попередників гемопоезу; крім того, лімфоцити стимулюють макрофаги до продукції гемопоетинів (Дыгай A.M., Клименко Н.А., 1992).

Посилення виходу каріоцитів у кров пов'язано, очевидно, з системними судинорозширювальними ефектами гістаміну та інших БАР ТБ, а також зі стимуляцією ними моноцитів-макрофагів – основних продуцентів могутніх вазодилататорів – простагландинів, оксиду азоту, а також ІЛ-1, ФНП та інших медіаторів, що мають системні гемодинамічні ефекти, і, відповідно, зі збільшенням кровотоку в кістковому мозку, тобто з вимиванням клітин (Дыгай A.M., Клименко Н.А., 1992). У свою чергу, посилення виходу лейкоци­тів з кісткового мозку в кров має значення у підтримці судинно-ексудативно-інфільтративних явищ, «гостроти» процесу, у стримуванні швидкої хронізації запалення. Мабуть, обмеження ТБ активності гемопоезу взаємопов'язане зі зменшенням під їх впливом еміграції лімфоцитів, а посилення виходу лейкоцитів з кісткового мозку в кров – з підвищенням еміграції нейтрофілів і моноцитів.

Подальшим етапом дослідження стало з'ясування ролі всієї тучноклітин­ної системи в реакціях системи крові при хронічному запаленні. Раніше було показано, що при гострому запаленні спостерігається дегрануляція не тільки ТБ вогнища, але й, природно, меншою мірою ТБ поза вогнищем запалення (Липшиц Р.У., Клименко Н.А., 1980). Під час вивчення клітинно-тканинної динаміки вогнища виявлено, що при хронічному запаленні, викликаному на тлі попереднього системного видалення ТБ, у вогнищі спостерігаються менш виражене порівняно з локальним усуненням ТБ зниження вмісту нейтрофілів та еозинофілів, запізнювання акумуляції макрофагів, менше накопичення і відмінність у динаміці лімфоцитів, менше зниження вмісту фібробластів і відмінність їх динаміки, раніше формування грануляційної тканини, але зниження в ній ангіо- та колагеногенезу. Це показує, що в регуляції клітинно-тканинних реакцій при хронічному запаленні беруть участь не тільки ТБ вогнища запалення, а й вся тучноклітинна система і незалежно від джерела БАР ТБ стримують прогресування хронічного запалення.

БАР ТБ поза вогнищем запалення, як видно, беруть безпосередню участь у подіях вогнища і при недостатності БАР ТБ вогнища, мабуть, багато в чому це компенсують. Вони можуть проникати у вогнище шляхом дифузії з периферії, надходити спочатку в кров і потім з ексудатом у вогнище, змінювати проникність судин вогнища, еміграцію лейкоцитів, гемопоез, вихід клітин з кісткового мозку в кров і далі у вогнище і, таким чином, модифікувати надход­ження у вогнище інших медіаторів і з інших джерел.

Під час вивчення кістковомозкового кровотворення і лейкоцитарної реакції периферичної крові з’ясовано, що ТБ поза вогнищем запалення відіграють роль і в інших реакціях системи крові при хронічному запаленні. Системне видалення ТБ спричинює більш виражену активацію гемопоезу і зниження виходу каріоцитів з кісткового мозку в кров при хронічному запаленні, ніж локальне усунення ТБ. Це явище цілком можна пояснити: системне видалення ТБ призводить до більш значущого дефіциту їх БАР в організмі, що, у свою чергу, спричинює, з одного боку, розгальмування гемо­поезу, обмежуваного БАР ТБ за природних умов хронічного запалення, а з іншого – менше вимивання лейкоцитів з кісткового мозку в кров.

Одержані результати і дані літератури дозволяють уявити собі роль ТБ у патогенезі хронічного запалення таким чином (рисунок). Під впливом запаль­ного агента, а також медіаторів з інших джерел відбувається активація (дегрануляція) ТБ; БАР ТБ викликають: вазодилатацію і підвищення проникності судин, що призводить до ексудації та утворення запального набряку, завдяки чому посилюється боротьба з флогогеном за рахунок медіаторів плазми; активацію нейтрофілів і моноцитів з їх еміграцією та розвитком лейкоцитарної інфільтрації, накопиченням і активацією макрофагів; лейкоцити здійснюють елімінацію флогогену, ушкоджених тканин і стиму­люють фібробласти до репарації; активацію фібробластів з розвитком репаративних явищ (ангіо- та колагеногенез, утворення грануляційної тканини); посилення кровотоку в кістковому мозку і виходу лейкоцитів у кров. Іншими словами, ТБ посилюють судинно-ексудативно-інфільтративні та репаративні, тобто прозапальні, явища, «гостроту» процесу, протидіючи швидкій його хронізації. Крім того, БАР ТБ: пригнічують лімфоцити, одні з основних ефекторів хронічного запалення, і обмежують активацію гемопоезу, особливо лімфопоезу, і, таким чином, також стримують прогресування хронічного запалення.