МОДИФІКАЦІЯ in vitro БІОЛОГІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КЛІТИН РАКУ ЛЕГЕНІ ЛЮДИНИ ІНТЕРФЕРОНОМ-АЛЬФА : МОДИФИКАЦИЯ in vitro биологических свойств клеток рака легких человека интерферона-АЛЬФА

summary

Матеріали та методи дослідження. Культивування клітинної лінії А-549 та модифікацію її до ІФН проводили в поживному середовищі RPMI-1640 з 10% ембріональної сироватки телят у зволоженій атмосфері з 5% СО₂  при 37ºС. Для модифікації клітин цитокіном використовували рекомбінантний лейкоцитарний інтерферон людини І-го типу (інтерферон-альфа 2b): їх довгостроково (до 380 діб) культивували in vitro в присутності зростаючих концентрацій цитокіну (від 100 до 10 тис. МО/мл). Діапазон доз був обраний після дослідження чутливості клітин А-549 до ІФН: було виявлено, що ІС50 становить 300 МО/мл. Адаптацію клітин до ІФН починали з дози, яка становила ІС30. В результаті, через 3 місяці культивування клітин А-549 з ІФН в зростаючих концентраціях, отримали сублінію, що була резистентна до 10 тис. МО/мл ІФН. Протягом експерименту визначали біологічні та цитогенетичні характеристики клітин лінії А-549, модифікованих різними дозами цитокіну (2 тис. МО/мл, 240 діб та 10 тис. МО/мл, 360 діб). При дослідженні кінетики росту клітин А-549 та модифікованих ІФН субліній підрахунок клітин здійснювали щодоби (протягом 6 діб) за допомогою гемоцитометра, фарбували клітини вітальним барвником – трипановим синім. Для морфологічних досліджень клітин використовували живі культури, а також цитологічні препарати, фарбовані за Майн-Грюнвальд-Гімза. Для більш детального морфологічного дослідження клітин А-549 контрольних та модифікованих ІФН, зокрема їх ядер та ядерцевих структур, цитологічні препарати фарбували азотистим сріблом або/і комбінованим методом фарбування: азур-еозином та сріблом (Howell W.M., 1980).

Для дослідження ультраструктурних особливостей клітин останні вирощували на поліетиленфталатній мембрані і аналізували за допомогою методу електронної мікроскопії (Лившиц В.Л., 1985).

Цитогенетичні дослідження проводили за стандартною методикою (Мамаєва С.Е., 2002). Морфологічні і цитогенетичні препарати аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопу AxioStarPlus (Сarl Zeiss, Germanу) при збільшенні у 200-1000 разів. Препарати живих та фарбованих клітин фотографували за допомогою цифрового фотоапарату Canon (PowerShot G6, UK) та комп’ютерних програм FotoCanvas та Photostudio 5. Кількість фігур мітозу, двоядерні клітини, клітини з мікроядрами і апоптозні клітини розраховували на 1000 клітин (в промілях (‰)).

Для порівняльного дослідження біологічних властивостей пухлинних клітин, які характеризують їх злоякісний фенотип in vitro, визначали рівень автономності росту контрольних та модифікованих ІФН клітин – здатність їх до росту у безсироватковому середовищі, рівень колонієутворення у середовищі з агаром та субстраті, максимальну щільність росту, рівень їх клонування за методом кінцевих розведень та адгезію до субстрату з колагеновим покриттям (Фрешни Р., 1989, Еш Б.Б. та співавт., 1985).

За допомогою імуноцитохімічного методу (Глузман Д.Ф. та співавт. 2000) досліджували експресію ядерного антигену проліферуючих клітин – Кі-67 (MIB1, Dako), білка адгезії – Е-кадгерину (clone NCH-38, Dako), білків, пов’язаних з лікарською резистентністю – Pgp (clone C494, Dako), Gst (clone 353-10, Dako), фактора росту ендотеліальних клітин – VEGF (clone VG1, Dako), рецептора епідермального фактору росту – EGFR (K1494, Dako), білків залучених в процес апоптозу – p53 (clone DO-7, Dako), Bcl-2 (clone 124, Dako). За допомогою методу проточної цитофлуориметрії визначали кількість апоптичних клітин, а також клітин, що експресують активну форму каспази-3 (набір "mAb Apoptosis Kit FITC" BD Bioscience Pharmingen, США), CD95 (Fas-антиген), Bcl-2 та білки АВС-транспортери (Pgp, MRP, LRP). В цих дослідах використовували моноклональні антитіла (МКАТ) фірм Kamiya BioMedical Company, USA: anti-Fas (клон 3.22), anti-Pgp (клон MRK1G), anti-MRP (клон MRPm6), anti-LRP (клон LRP-56); Cymbus Biotechnology, USA - anti-Bcl-2. Дослідження проведені на проточному цитофлуориметрі FACScan (Beckton Dickinson, США).

Експресію в клітинах мРНК топоізомерази ІІ-α визначали за методом ЗТ-ПЛР з використанням комплектів „Рибо-золь-А” та „РЕВЕРТА-L” („Амплисенс”, Росія). В якості контролю якості реакції використовували специфічний праймер до GAPDH (гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа).

Рівень секреції VEGF клітинами А-549 досліджували імуноферментним методом за допомогою відповідної тест-системи до VEGF (Лісняк І.О., 2004).

          При дослідженні чутливості клітин А-549 та субліній, модифікованих ІФН, до хіміопрепаратів (адріабластин, фарморубіцин, метотрексат “Ебеве”, елоксатин, флуоурацил, таксолік), солей металів (CdSO₄, MnSO₄, HgCl₂ та Pb-ацетат), гіпертермії, механічного стресу, фактору некрозу пухлин (ФНП) (Recombinant Human TNF-alpha, GF023, Chemicon - від 100 до 10 тис. МО/мл) використовували стандартні методики визначення кількості і життєздатності клітин: фарбування клітин трипановим синім, МТТ або сульфородаміном B (Skehan P. et al., 1990; Rubinstein L. et al., 1990).

          Для вивчення впливу гіпертермії на клітини, останні прогрівали в суспензії при 42 або 45⁰С протягом 1 години в поживному середовищі RPMI 1640, інкубували після прогріву 24, 48 та 72 години за стандартних умов. Життєздатність клітин, що зазнали впливу гіпертермії, та їх чутливість до подальшої дії цитостатиків визначали як вказано вище.

Чутливість контрольних та ІФН-модифікованих клітин А-549 до механічного стресу проводили за рекомендаціями Kataoka et al.,(1994), Butcher D.T. et al., (2009). Морфологічні зміни в клітинах після  механічного стресу проводили за допомогою електронної мікроскопії.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою математичної програми медико-біологічної статистики STATISTIСA 6.0. Обчислення і порівняння достовірності відмінностей середніх величин проводили з використанням t-критерію Ст’юдента; достовірними вважали відмінності з вірогідністю не менше 95% (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

          Дослідження фенотипових особливостей клітин А-549 за умов тривалої дії на них інтерферону. В процесі проведення досліджень основна увага була зосереджена на модифікації ІФН того комплексу фенотипових ознак пухлинних клітин, що характеризують їх злоякісний фенотип, а саме: морфологію та ультраструктуру, характер та автономність росту клітин, чутливість до дії різних факторів, експресію білків, пов’язаних з апоптозом, лікарською резистентністю, ангіогенезом та цитогенетичні особливості клітин. Всі характеристики ІФН-модифікованих клітин протягом всього експерименту порівнювали з такими ж характеристиками клітин вихідної лінії А-549, які не контактували з цитокіном.

Встановлено, що в процесі тривалої експозиції клітин А-549 з ІФН в них формувалась стійкість до антипроліферативної дії цитокіну. Більшість клітин при цьому набували епітелієподібної морфології, збільшувався час їх подвоєння, знижувалась щільність росту клітин за рахунок зменшення їх здатності до багатошарового росту (рис. 1). За даними електронної мікроскопії, внаслідок модифікації клітин ІФН відбулось ускладнення системи клітинних органел: різко збільшилась кількість канальців гранулярного ендоплазматичного ретикулуму, зросла чисельність лізосомальних гранул, мітохондрій та цистерн комплекса Гольджі. Такі зміни ультраструктурної організації клітин свідчать про зростання їх функціональної активності та більш високий рівень їх диференціювання.