ВПЛИВ КОМБІНОВАНОЇ ДІЇ СОЛЕЙ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ І СТРЕСУ НА ХРОНОРИТМИ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ, ФІБРИНОЛІТИЧНОЇ ТА ПРОТЕОЛІТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ НИРОК (експериментальне дослідження) : ВЛИЯНИЕ КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ солей тяжелых металлов и стресса НА хроноритмы ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ, ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ И протеолитической активности ПОЧЕК (экспериментальное исследование)

summary

Матеріал і методи досліджень. В дослідах на 248 статевозрілих нелінійних самцях білих щурів масою 150-200 г вивчали вплив (14-добової) дії хлористих сполук талію, свинцю і алюмінію на функціональний стан нирок.

Під час досліджень дотримувалися Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000 р. «Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин» досліди проведені відповідно до вимог комісії з біоетики БДМУ (протокол №3 від 16.02.2005).

Стать тварин була обрана у зв’язку з меншими перебудовами циклічно-фізіологічними змінами та більшою чутливістю нейроендокринної регуляції стрес-реактивності у самців. У самок адаптативні системи більш чутливі до дії гострих та довготривалих фізіологічних стресів і забезпечують різнобічну адаптацію до стресових подразників. У самців легше виявити ендокринні, нейрохімічні та біохімічні кореляти порушень стрес-реактивності, тоді як у самок адаптативні системи більш сталі, економні, динамічні і мають більш резервну потужність. Використання в експерименті статевозрілих тварин зумовлено тим, що в цьому віці нейроендокринна система повністю сформована, тварини більш витривалі до різних негативних дій. Вказаний вік дозволяє трактувати виявлені відхилення саме як вірогідні результати впливу солей важких металів і стресу на нирки.

Функціональний стан нирок тварин вивчали при фізіологічному стані шишкоподібної залози, а також за умов впливу комбінованої дії солей важких металів, а саме хлористих сполук талію, свинцю і алюмінію та гострого 1-годинного іммобілізаційного стресу на фоні фізіологічної функції шишкоподібної залози.

Тварин поділяли на інтактну та дослідні групи. Дослідним щурам уводили солі важких металів внутрішньошлунково, одноразово о 12.00 год протягом 14 діб. Застосовували розчин солей важких металів: талію хлориду (у дозі 10 мг/кг маси тіла), свинцю хлориду (у дозі 50 мг/кг маси тіла) та алюмінію хлориду (у дозі 200 мг/кг маси тіла) за умов іммобілізаційного стресу. Через кожних 6 год наприкінці експерименту тваринам проводили 5 % водне навантаження підігрітою до кімнатної температури водогінною водою і досліджували функцію нирок за умов форсованого діурезу. На 14-ту добу експерименту досліджували хроноритми екскреторної, іонорегулювальної і кислотовидільної функцій нирок, а також показників фібринолітичної та протеолітичної активності тканин нирки, сечі та крові.

З метою корекції порушень функцій нирок піддослідні тварини отримували препарат «Віта-мелатонін» (табл. 0,003, ЗАТ “Київський вітамінний завод”, м. Київ), який уводили в дозі 0,3 мг/кг маси тіла одноразово внутрішньошлунково через зонд у вечірній час за 1 год до іммобілізаційного стресу (Пішак В. П. та ін., 2006).

Отримані індивідуальні хронограми для кожної тварини групували за принципом ідентичності максимальної акрофази і розраховували методом косинор-аналізу пересічні для кожної групи хронограм мезор, амплітуду і фазову структуру (за інтервалом часу між акро- та батифазою). Діагностика десинхронозу грунтувалася на основі аналізу змін характеристик мезору (середньодобового рівня), амплітуди, акрофази та форми кривої циркадіанного ритму.

Методи вивчення екскреторної, іонорегулювальної та кислотовидільної функцій нирок. Екскреторну функцію нирок оцінювали за величинами абсолютного та відносного діурезу, концентрації та екскреції іонів калію в сечі, концентрації креатиніну в сечі, швидкості клубочкової фільтрації, концентрації креатиніну в плазмі крові, відносної реабсорбції води, концентраційного індексу ендогенного креатиніну, концентрації та  екскреції білка в сечі. У тварин величину діурезу оцінювали в мл/2 год/100 г маси тіла. Концентрацію креатиніну в плазмі крові визначали за методом А. К. Меєрзона, 1968, в сечі – за методом В. М. Магаляса, 1969. Концентрацію білка в сечі визначали фотоколориметрично за реакцією із сульфосаліциловою кислотою (Михеєв А. И., 1969).

Іонорегулювальну функцію оцінювали за показниками екскреції іонів натрію та їх концентрації в сечі, абсолютної та відносної реабсорбції катіону, фільтраційного заряду та кліренсу іонів натрію, натрій-калієвого коефіцієнта сечі, концентрації іонів натрію в плазмі крові, концентраційного індексу іонів натрію, величин проксимального та дистального транспорту. Концентрацію іонів натрію та калію в сечі і плазмі крові реєстрували методом фотометрії полум`я на фотометрі “ФПЛ-I” (Стеновая Е. А., 2001).

Кислотовидільну функцію нирок харак­теризували за концентра­цією актив­них іонів водню в сечі (рН сечі), екскрецією активних іонів водню, титрова­них кислот і аміаку (Sauve R. et al., 2000). Визначення рН сечі здійснювали за допомогою мікробіоаналізатора “Redelkys” (Угорщина), концентрацію кислот і аміаку в сечі – методом титрування (Шюк О., 1982).

Стандартизації показників функцій нирок досягали доведенням їх до оди­ниці на 100 г маси тіла тварини або об’єму клубочкового фільтрату на 100 мкл.

Тканинний фібриноліз у кірковій, мозковій речовині та в сосочку нирок, сечі та плазмі крові оцінювали з використанням реактивів фірми “Simko Ltd.” (Львів) шляхом визначення лізису азофібрину з оцінкою сумарної (СФА), неферментативної (НФА) і розрахунком ферментативної фібринолітичної активності (ФФА). На спектрофотометрі СФ-46 в кюветах при довжині хвилі 440 нм проти розчину порівняння проводили замір оптичної густини проб. Отримані екстинції перераховували на 1 г тканини на 1 год інкубації (Магаляс В. М. і співавт., 2001).

            За аналогічним методом визначали протеолітичну активність кіркової, мозкової речовини та сосочка нирок, плазми крові і сечі, використовуючи колорогенні сполуки: азоальбумін (лізис низько-молекулярних білків), азоказеїн (лізис високомолекулярних білків) та азоколаген (лізис колагену) (“Simko Ltd.”, Львів) (Магаляс В. М. і співавт., 2001).

Для визначення урокіназної активності сечі плазміноген інкубували із сечею, яка містила урокіназу, внаслідок чого відбувалася активація проферменту в активний плазмін. Активність останнього визначали за ступенем лізису азофібрину (Бойчук Т. М., 1999).

Статистичну обробку отриманих даних проводили на ПЕВМ “Pentium-366” за допомогою програм “Excel-7”, “Statgraphics” (США) і “Косинор-аналіз” (визначення мезора, амплітуди, акрофази, батифази), а також параметричними методами варіаційної статистики (Емельянов И. П., 1986). Вірогідність різниці показників визначали з використанням t-критеріїв Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення. Слід зазначити, що функціональна, фібринолітична та протеолітична активності нирок підпорядковані чіткій циркадіанній періодичності (Рапопорт С. И. и др., 2006).

Динаміка перебудов хроноритмів функцій нирок у тварин, яким моделювали іммобілізаційний стрес на фоні уведення солей важких металів. У тварин, яким моделювали іммобілізаційний стрес на фоні внутрішньошлункового уведення солей важких металів на 14-у добу реєстрували порушення хроноритмів більшості показників екскреторної, іонорегулювальної та кислотовидільної функцій нирок.

Спостерігали прояв олігурії - зниження швидкості клубочкової фільтрації. Мезор ритму в 2 рази нижчий контрольного рівня, а амплітуда вірогідно знижувалася. Зміщення акрофази на 02.00 год (267,36±21,047 мкл/хв/100 г) змінило фазову структуру ритму.

Збільшення мезору екскреції білка, на 100 мкл клубочкотаблвого фільтрату, з акрофазою о 02.00 год (0,20±0,065 мг) вказувало на пошкодження гломерулярно-тубулярних процесів ниркового транспорту протеїнів. Батифаза зміщалася з 14.00 на 08.00 год зі зниженим мезором. Амплітуда коливань зростала майже в 2 рази.

Інверсної структури набував ритм відносної реабсорбції води з мініфазою о 14.00 год (86,77±0,931 %), що й стало причиною підвищення діурезу в цей період. Мезор ритму не змінювався, а амплітуда зростала (з 0,9±0,30 % до 2,8±0,74 %).

Спостерігалася синфазність екскреції іонів натрію, акрофаза ритму припадала на 02.00 год доби (0,97±0,153 мкмоль/100 мкл клубочкового фільтрату). О 14.00 год величини екскреції іонів натрію наближалися до мінімального рівня. Амплітуда коливань знижувалася майже в 2 раза в дослідних тварин.

Необхідно відмітити, що підвищення екскреції іонів натрію спостерігали за умов низького фільтраційного завантаження нефрона. Такі зміни вказують на пошкодження транспортних систем іонів натрію, які не забезпечували ефективної реабсорбції катіону навіть при низькій його концентрації в первинній сечі. Доказом було вірогідне зниження мезору проксимальної реабсорбції катіона (рис. 1). Порушувалася синфазність ритмів фільтраційного заряду та проксимальної реабсорбції іонів натрію.