МЕХАНІЗМИ ПОРУШЕННЯ ФУНКЦІЇ І СТРУКТУРИ ЕНДОТЕЛІОЦИТІВ ЕНДОКАРДА ТА МІКРОЦИРКУЛЯТОРНОГО РУСЛА МІОКАРДА ПРИ ЕМОЦІЙНОМУ СТРЕСІ, ГІПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМІЇ І ЇХ ПОЄДНАННІ : МЕХАНИЗМЫ НАРУШЕНИЯ ФУНКЦИИ И СТРУКТУРЫ Эндотелиоциты эндокардом И микроциркуляторного русла миокарда при эмоциональном стрессе, гиперхолестеринемия и их сочетания

summary

Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на 165-и білих безпородних статевозрілих щурах-самцях масою 180-240 г і 92-х кролях масою 2,0-3,0 кг, які утримувалися в умовах кафедрального віварію і були поділені на 4 групи: 1-а – контрольна (інтактні тварини, які отримували звичайну для них їжу); 2-а – тварини, які перебували на атерогенній дієті; 3-я – тварини, що приймали звичайну їжу та піддавалися дії емоційно-больового стресу (ЕБС) різної тривалості; 4-а – тварини з аліментарною гіперхолестеринемією (ГХЕ), які піддавалися впливу стресу. Експериментальні дослідження проведені згідно вимог комісії з біоетики ІФНМУ (протокол № 17/07 від 22 лютого 2007р).

ЕБС у кролів та щурів моделювали за методом O. Desiderato еt al. (1974).

Для моделювання аліментарної ГХЕ щурам щоденно протягом 60 діб через зонд в ротову порожнину вводили 250 мг ХС в 1 мл свинячого сала із обов’язковим додаванням жовчних кислот. Кролі щоденно протягом 30 діб через шприц, з’єднаний з гумовою трубкою, яку вводили в ротову порожнину, отримували 20 % емульсію ХС в рослинній олії (0,3 г/кг маси тіла) [Peiler F.U. et al., 1986]. Матеріал (кров і серце) забирався під нембуталовим наркозом із розрахунку 40 мг/кг маси тварини.

Для визначення ХС у сироватці крові використовували фотоколориметричний метод, в основі якого лежить якісна реакція Лібермана-Бурхарда [Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н., 1985]. Дослідження ліпідного складу серцевого м’язу і ендокарду здійснювали методом екстрагування жирів сумішшю хлороформу та метанолу [Folch. J. et al., 1957]. Вміст вільних жирних кислот (ВЖК) і фракцій нейтральних ліпідів у досліджуваних структурах проводили після попередньої тонкошарової хроматографії на силікагелі („Voelm”, Англія). Розміщення фракцій визначали за відповідними стандартами, в ролі яких використовували ВЖК, триацилгліцерини (ТАГ) („Serva”, Німеччина), ХС („Reanal”, Угорщина), ХС олеат (,,Amersham”, Англія). Кількісну оцінку проводили за допомогою тест-наборів ,,Хемапол” (Чехія). Вміст ВЖК визначали радіохімічним методом [Hanina B., Shoshana A., 1987].

Визначення маркерів пошкодження плазматичної мембрани ендотеліоцитів проводили після попереднього осадження ендотеліальних тілець на фільтрі із діаметром пор 0,25 мкм [Герелюк І.П. та ін., 1998]. Дослідження вмісту фактора Віллебранда і тромбомодуліну у плазмі крові та ендотеліальних тільцях здійснювали імуноферментним методом, використовуючи набори “Еnzyme-linked immunosorbent assay” (ELISA „Diagnostica Stago Asniers”, Франція).

Вміст адреналіну, норадреналіну та дофаміну у плазмі крові визначали радіоферментним методом за допомогою стандартних наборів „Катехола” (Чехія).

Дослідження вмісту ейкозаноїдів у плазмі крові, серцевому м’язі та ендокарді проводили за допомогою радіоімунного методу, використовуючи наступні тест-набори: 1) ³H–prostaglangin E₂ („Clinical Assays”, США); 2) ³H – prostaglangin F_2α RIA KIT („Direct”, Угорщина); 3) ¹²⁵I-tromboxane B₂ RIA KIT („Direct”, Угорщина); 4) ¹²⁵I-6–keto-prostaglangin F_1α RIA KIT („Direct”, Угорщина). Активність ферменту 5’-нуклеотидази визначали високочутливим радіоферментним методом [Banditeelli S. еt al., 1996].

Ступінь ушкодження ендотелію ендокарду шлуночків встановлювали за кількістю злущених клітин у мазках-відбитках на 1мм² площі. Мазки-відбитки готували окремо з макропрепаратів ендокарду лівого і правого шлуночків, прикладаючи їх до предметних скелець. Ендотеліоцити у мазках- відбитках фарбували за методом Д.Л. Романовського (1890). Встановлено, що одне поле зору (ок´7; об´90) відповідає площі 0,025 мм², тобто, для визначення кількості злущених ендотеліоцитів на площі 1 мм² відбитку ендокарду проводили підрахунок клітин у 40 полях зору [Автандилов Г.Г., 1990].

Матеріал (ендокард та міокард шлуночків) для електронномікроскопічного дослідження готували за загальноприйнятим методом. Ультратонкі зрізи досліджували і фотографували на мікроскопах УЕМВ-100В і ПЕМ-100 (ВАТ „SELMI”, Україна) з прискорюючою напругою 75 В.

Для фармакологічної корекції пошкоджень ендотелію використовували:

1) L-аргінін (10 % олійний розчин в ампулах по 10 мл, виробництва „LAPHAL”, Франція) перорально в дозі 100 мг/кг перед моделюванням ЕБС і щодня паралельно з атерогенною дієтою;

2) фентоламін (порошок по 0,025 г, виробництва „Здоров’я”, Україна) та пропранолол (0,1 % розчин в ампулах по 1 мл, виробництва „Здоров’я”, Україна) одноразово внутрішньовенно перед початком стресового впливу (0,5 мг/кг);

3) індометацин (порошок по 0,025 г, виробництва „Здоров’я”, Україна) вводили за допомогою зонда в шлунок за 90 хв до початку дії ЕБС (10 мг/кг);

4) фіноптин (0,25 % розчин в ампулах по 2 мл, виробництва „ORION”, США) внутрішньом’язово за 30 хв до стрес-реакції (2,5 мг/кг);

5) простенон (0,1 % розчин в ампулах по 1 мл, виробництва „Здоров’я”, Україна) внутрішньом’язово за 15 хв перед дією стресора (0,8 мг/кг).

Досліджувались наступні показники: кількість злущених ендотеліоцитів у мазках-відбитках з ендокарду лівого шлуночка, вміст вільних жирних кислот в ендокарді та міокарді та вміст ендотеліальних тілець у крові (за маркером пошкодження ендотеліоцитів – фактором Віллебранда).

Варіаційно-статистичну обробку отриманих даних здійснювали з використанням t-критерію Стюдента [Ойвин И.А., 1960]. Відмінності вважались статистично достовірними при р<0,05. Обробка отриманих результатів проведена за допомогою ПЕОМ з використанням програмного пакету Microsoft Excel-2000.

 Результати дослідження та їх обговорення. Результати проведених дос-

ліджень показали, що вже після дії одногодинного ЕБС має місце різке зростання концентрації катехоламінів у крові. Так, у порівнянні з контролем рівень адреналіну і норадреналіну підвищується відповідно у 8,5 і 7,1 рази, дофаміну - у 18,4 рази, а після дії тригодинного стресу ще більше зростає концентрація дофаміну, тоді як рівні адреналіну і норадреналіну дещо знижуються. Це є свідченням вираженої активації симпатоадреналової системи (САС), на що вказують і інші дослідники [Клименко В.І., 2005; Погосова Г.В., 2007]. На фоні такої активації САС у крові різко зростає рівень простагландинів (ПГ) класів Е₂, F_2α та І₂, який чітко корелює з тривалістю дії стресора і носить, на нашу думку, захисний характер, оскільки відіграє певну роль у обмеженні пошкоджуючої дії на серцево-судинну систему катехоламінів. Разом з тим, у крові збільшується вміст і тромбоксану А₂ (ТхА₂), але індекс ТхА₂/ПГІ₂ зростає (у 2,1 рази, р<0,001) тільки після 0,5 год від початку дії стресу. Подалі він знижується, що є наслідком компенсаторного підсилення синтезу простацикліну (ПГI₂), особливо, у скелетних м’язах [Мельник С.Б., 1994; Малая Л.Т., Корж А.Н, 2000]. Поряд з цим підсилюється синтез ПГІ₂ і в ендокарді та міокарді, що також корелює із тривалістю дії стресора. Зокрема, при одногодинному стресі в ендокарді вміст цього ПГ зростає з 1290,00 до 2291,25 пг/г тканини (р<0,001), у міокарді - з 1675,00 до 2502,50 пг/г тканини (р<0,001). Одночасно із збільшенням концентрації ПГІ₂ у міокарді зростає і рівень ТхА₂. Так, після 0,5, 1 і 3 год від початку дії стресора рівень цього ПГ у серцевому м’язі збільшується відповідно у 1,7, 2,2 і 3,0 рази (р<0,001) у порівнянні з контролем (213,75 пг/г тканини). При цьому синтез ТхА₂ все ж випереджає продукцію ПГІ₂, тому індекс ТхА₂/ПГІ₂ зростає.

Поряд із порушенням рівноваги у простациклін-тромбоксановій системі, під впливом стресу відбуваються виражені зміни у ліпідному складі плазматичних мембран клітинних структур міо- і ендокарду. Так, після тригодинної стрес-реакції у міокарді щурів на 62,5 % збільшується вміст ВЖК (р<0,001) і на 23,0 % зменшується рівень етерифікованого ХС (р<0,001), тоді як концентрація вільного ХС і ТАГ змінюється статистично невірогідно. У ендокарді такі зміни носять дещо інший характер, а саме, рівні неетерифікованого ХС та ВЖК у ньому збільшуються відповідно на 13,9 % і 36,8 % (р<0,001), а вміст етерифікованого ХС та ТАГ зменшується відповідно на 17,7 % (р<0,001) і 11,2 % (р<0,05). Накопичення вільного ХС та ВЖК, особливо у ендокарді, імовірно, відбувається за рахунок гідролізу ефірів ХС та ТАГ. При цьому ВЖК на фоні збільшення потреб міокарду в кисні потенціюють ушкоджуючу дію катехоламінів на серце, підвищують проникність клітинних мембран, сприяють накопиченню агрегатів тромбоцитів у мікроциркуляторному руслі [Мхитарян Л.С. та ін., 1998; Міщенко І.В., 2002; Барабой В. А., 2006].

Внаслідок ушкодження плазматичної мембрани ендотеліоцитів під впливом стресу, відбувається суттєве збільшення в крові тромбомодуліну (41,25 проти 24,25 нг/мл в контролі, р<0,001) і фактора Віллебранда (21,78 проти 10,50 нг/мл, р<0,001). Крім того, з ушкоджених клітин вивільняється 5’-нуклеотидаза, активність якої у плазмі крові підвищується у порівнянні з контролем в 1,6 рази. Під впливом цього ферменту підсилюється розпад аденозинмонофосфорної кислоти і збільшується утворення аденозину, який володіє вазодилататорною та антиагрегаційною дією, що є важливою ознакою компенсаторно-пристосувальних реакцій при стресі.

Морфологічні методи підтверджують ушкоджуючий вплив стресу на ендокард шлуночків та ендотелій мікроциркуляторного русла міокарда. Електронномікроскопічно виявляється набряк ендотеліоцитів, трансформація їх цитоплазматичних мікровезикул та мікропіноцитозних пухирців у вакуолі різного розміру, часткове руйнування мембранних органел. Люменальна частина плазматичної мембрани утворює численні пальцеподібні випинання, які часто відокремлюються від клітин і у вигляді ендотеліальних тілець (цитопластів) вільно перебувають у просвіті капілярів. У більш пізньому періоді спостерігається відшарування і повна десквамація окремих ендотеліоцитів. Кількість ендотеліальних тілець та ендотеліоцитів, які циркулюють у крові, перебуває у прямій залежності від тривалості стресового впливу. Так, при тригодинному стресі кількість ендотеліоцитів у полі зору мікроскопа збільшується у порівнянні з контролем у 2,0 – 2,1 рази. Це супроводжується візуальним збільшенням кількості ендотеліальних тілець у циркулюючій крові, що визначається за допомогою електронної мікроскопії. Таке ж збільшення кількості циркулюючих ендотеліоцитів та їх фрагментів у крові виявляється шляхом визначення концентрації досліджуваних маркерів ендотеліальної дисфункції (ЕД) (тромбомодуліну, фактора Віллебранда, 5’-нуклеотидази) у матеріалі, який залишився на фільтрі після фільтрації плазми крові. Слід відмітити, що у післястресовому періоді ступінь ушкодження ендотеліоцитів ендокарда лівого шлуночка значно зростає. Особливо таке явище виражене через 24 год після стресового впливу. В цей період після тригодинної дії стресора кількість злущених клітин у мазках-відбитках у 2,2 рази є більшою у порівнянні з кількістю клітин, зафіксованою відразу після впливу ЕБС. Подібні зміни описуються при хронічному стресі та гіперадреналінемії в аорті [Гавриш А. С., 1997, 2005], при надмірних фізичних навантаженнях у стегновій артерії [Кремінська І. Б., 2006].

У тварин, які перебували на атерогенному раціоні, суттєво збільшується вміст у плазмі крові загального ХС (у щурів з 1,53 до 2,78 ммоль/л, р<0,001, у кролів – з 1,34 до 5,34 ммоль/л, р<0,001). Крім того, як у щурів, так і у кролів відмічається зменшення ХС-акцепторної функції ліпопротеїнів високої щільності (ЛПВЩ) (через зниження їх концентрації у плазмі крові), що, як відомо, є одним із механізмів накопичення ХС у мембранах клітин крові, аорти і міокарда [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Ляшенко В.П., 2003] і сприятливим фактором для розвитку ендотеліальної дисфункції.

Зміни рівнів загального ХС і холестерину ЛПВЩ у плазмі крові супроводжуються зростанням вмісту вільного ХС у плазматичних мембранах клітин міокарду та ендокарду. У міокарді вміст вказаного ліпіду збільшується на 12,4 % (р<0,01), в ендокарді – на 13,0 % (р<0,01). Порівняльна характеристика зрушень у ліпідному спектрі дозволяє нам зробити висновок, що накопичення цього ліпіду має місце як у плазматичних мембранах ендотелію ендокарду, так і у відповідних структурах ендотеліоцитів капілярів міокарду.

Крім виражених порушень у ліпідному спектрі мембранних структур клітин міокарду та ендокарду, у таких тварин у серцевому м’язі відбуваються зміни вмісту досліджуваних ПГ. Так, у щурів, які знаходилися на атерогенному раціоні, рівень ТхА₂ в міокарді у порівнянні з контрольними даними зростає на 63,1 % і не компенсується адекватним збільшенням продукції ПГІ₂, оскільки його вміст зростає тільки на 18,6 %. Такий дисбаланс у концентрації різних груп ПГ є передумовою вазоконстрикції коронарних артерій і підвищення тромбогенного потенціалу крові у судинах мікроциркуляторного русла міокарда [Panteghini M., 2004; Arehart E. et al., 2007]. Поряд з цим, зміни вмісту ПГІ₂ в ендокарді, ТхА₂ і ПГІ₂ у міокарді та їх співвідношення у плазмі крові цієї групи експериментальних тварин є невірогідними.

Значні порушення балансу ліпідів у крові та в структурах ендо- та міокарду, збільшення у них вмісту тромбоксану А₂ проявляються вираженими ознаками ушкодження ендотеліоцитів серця, які характеризуються збільшенням циркулюючих у крові ендотеліальних тілець на фоні незначної активності в них 5’-нуклеотидази. Якщо кількість ендотеліальних тілець (за фактором Віллебранда) збільшується у 6,7 рази, то активність 5’-нуклеотидази зростає тільки у 3,5 рази. Отже, при атерогенному раціоні на поверхні ендотеліальних тілець синтез аденозину сповільнюється. Поряд з цим, пригнічується синтез ендотеліоцитами ендокарду лівого шлуночка та самими ендотеліальними тільцями ПГІ₂, вміст якого, зокрема у ендотеліальних тільцях, зменшується у 1,7 рази (р<0,02). Цим самим створюються додаткові умови для коронароспазму та тромбоутворення.

Наявність ушкодження ендотеліоцитів ендокарду та мікросудин міокарду підтверджується морфологічними методами дослідження. Аналіз мазків-відбитків з ендокарду правого і лівого шлуночків засвідчує збільшення в них клітинних структур у порівнянні з контролем у 2,6 та 2,7 рази відповідно.

Вивчивши функціональні та структурні ознаки розвитку ЕД під впливом окремо взятих стресу та атерогенного раціону, ми дослідили морфо-функціональні особливості цих ознак за умов поєднаної дії обох патогенних факторів і відмітили цілий ряд його якісних та кількісних відмінностей.

У першу чергу такі відмінності стосуються особливостей проявів активації САС. Відмічено, що поєднання вищезгаданих факторів веде до збільшення концентрації у крові адреналіну і норадреналіну відповідно на 13,4 % і 18,0 % (у порівнянні з впливом одного тільки ЕБС), тоді як вміст дофаміну практично не змінюється. На нашу думку такий ефект обумовлюється тим, що атерогенний раціон, який передує стресу, викликає помітну активацію САС і призводить до вичерпання катехоламінових резервів та підвищення активності катехолруйнуючих ферментів (моноамінооксидази, катехолоксиметилтрансферази). Тому, на такому фоні вплив стресового фактора на САС є вже менш ефективним.

Дещо інший характер при поєднанні стресу і атерогенного раціону, у порівнянні з дією кожного із цих факторів зокрема, носять зміни в спектрі нейтральних ліпідів плазматичних мембран ендотеліоцитів ендокарда і дрібних судин міокарда. За таких умов вміст вільного ХС у міокарді зростає на 23,2, у ендокарді – на 32,4 %, що на 19,4 і 16,2 % перевищує аналогічні показники при впливі тільки стресу. Водночас, в ендокарді відбувається підвищення на 32,3 % вмісту і етерифікованого ХС. Крім того, в досліджуваних структурах цих тварин збільшується накопичення ВЖК, концентрація яких у міокарді зростає на 104,0, в ендокарді – на 57,9 %, тоді як при дії тільки стресу їх рівень у міокарді підвищується на 62,5 %, а в ендокарді – на 36,8 %. Ендогенним джерелом ВЖК при цьому, як стверджують окремі автори [Геннис Р., 1997, Климов А.Н. и соавт., 1999], можуть бути фосфоліпіди, ТАГ та ефіри ХС. Виходячи з цих даних, можна стверджувати, що стрес на фоні атерогенного раціону є надзвичайно небезпечним, оскільки супроводжується накопиченням у плазматичних мембранах клітин ендокарда і міокарда вільного ХС та ВЖК, що є одним із молекулярних механізмів їх ушкодження. Крім того, необхідно відмітити, що стресові ситуації є причиною виникнення ендогенної ГХЕ, яка разом з екзогенною поглиблює свій ушкоджуючий ефект [Пшенникова М.Г., 2000; Ляшенко В.П., 2003].

Підвищення вмісту ВЖК у досліджуваних структурах супроводжується зростанням концентрації вільної арахідонової кислоти, із якої під впливом циклооксигеназ синтезуються ПГ. Але синтез цієї групи біологічно активних речовин під впливом атерогенної дієти та стресу має виражені особливості і значно відрізняється від такого при впливі тільки стресу. Так, на відміну від стресу, коли в ендокарді і міокарді синтез ПГІ₂ підсилюється, то при поєднанні тригодинної стрес-реакції із атерогенним раціоном вміст цього простагландину знижується: у міокарді - на 40,0 %, в ендокарді - на 13,9 % (р<0,01). Поряд з цим, за таких умов різко зростає продукція тромбоцитами міокарда ТхА₂. Наприклад, якщо після 0,5 год впливу стресора на здорових тварин вміст цієї сполуки у міокарді збільшується в 1,6 рази (р<0,001), то при його поєднанні з атерогенною дієтою – у 2,2 рази. Після впливу тригодинного стресу цей показник є ще вищим. На фоні вираженого пригнічення синтезу ПГІ₂ ендотеліоцитами і підвищення продукції ТхА₂ тромбоцитами характерним для стресу у поєднанні з атерогенним раціоном є виражене збільшення ТхА₂/ПГІ₂ індексу, який опосередковано характеризує стан мікроциркуляції. Якщо в контрольній групі він становить 0,55, то за згаданих умов при півгодинному стресі – 0,84 (р<0,001), одногодинному – 1,17 і тригодинному – 1,37. Звідси можна зробити висновок, що при впливі стресу на фоні ГХЕ створюються сприятливі умови для вазоконстрикції та підвищення тромбогенного потенціалу крові, що, в свою чергу, призводить до виражених розладів мікроциркуляції не тільки у серцевому м’язі, а і в інших органах [Гавриш А.С., 1999; Малая Л.Т., Корж А.Н., 2000; Какауридзе Н. Г., 2001].

Зрушення в ліпідному складі плазматичних мембран ендотеліоцитів серця і дисбаланс у системі простагландинів при поєднаному впливі обох патогенних факторів супроводжуються змінами з боку маркерів ЕД, зокрема, різко підвищується вміст у плазмі крові тромбомодуліну і фактора Віллебранда. Відмічено, що у порівнянні з тваринами, які піддавалися дії тільки стресу, рівень тромбомодуліну зростає на 17,6 % (р<0,05), а фактора Віллебранда – на 49,7 %. На 38,0 % підвищується активність 5´-нуклеотидази. Крім того, в умовах атерогенного раціону стрес-реакція сприяє збільшенню кількості в крові циркулюючих ендотеліальних тілець та злущених ендотеліоцитів. Зокрема, за фактором Віллебранда цей показник зростає у 2,5 рази, за тромбомодуліном – у 2,7 рази. Однак, при цьому в згаданих клітинних структурах суттєво (на 24,2 %) знижується активність 5’-нуклеотидази і сповільнюється (на 33,7 %) синтез ПГІ₂. Зменшення утворення аденозину та простацикліну на поверхні ендотеліальних тілець є передумовою для їх взаємодії з тромбоцитами і запуску внутрішнього механізму зсідання крові [Arehart E. et al., 2007; Banditeelli S. et al., 2007].

Підсилення деструктивних змін та десквамації ендотеліоцитів при дії стресу в умовах атерогенної дієти підтверджується електронномікроскопічно та аналізом мазків-відбитків з ендокарда шлуночків (рис. 1).

Так, якщо після гострого тригодинного стресу кількість злущених ендотеліоцитів у мазках-відбитках з ендокарду правого і лівого шлуночків зростає у 4,3 рази, то на фоні ГХЕ їх кількість збільшується відповідно у 6,4 та 6,5 рази. При цьому у полі зору мікроскопа зустрічаються скупчення 20 і більше ендотеліоцитів, що вказує на можливе їх відшарування цілими пластами. Вищеописані процеси є ще одним механізмом тромбоутворення та розладів гемомікроциркуляції.