Місце й значення полімеразно-ланцюгової реакції у визначенні резистентності збудника туберкульозу до фармакологічних засобів : Место и значение полимеразной цепной реакции в определении резистентности возбудителя туберкулеза к фармакологическим средствам

summary

Матеріали та методи дослідження. Ретроспективне та проспективне вивчення резистентності M.tuberculosis до протитуберкульозних засобів було виконано в бактеріологічній лабораторії Одеської обласної клінічної протитуберкульозної лікарні (ООКПТЛ). Всього було проаналізовано дані про 224 культури збудника туберкульозу, з них 66 культур були виділені від хворих, які вперше лікувались з приводу туберкульозу, і 158 культур – від хворих з повторним лікуванням. Задля забезпечення об’єктивності визначення епідеміологічної ситуації щодо особливостей поширеності медикаментозної резистентності був використаний метод «поперечного зрізу» [Флетчер Р. и соавт., 1998]. Окремо вивчали рівень первинної і вторинної (набутої) резистентності збудника туберкульозу за даними бактеріологічної лабораторії ООКПТЛ. Вивчали медикаментозну резистентність до препаратів І ряду – ізоніазиду, рифампіцину, стрептоміцину, етамбутолу і піразинаміду, і ІІ ряду – канаміцину, амікацину, рифабутину, етіонаміду, офлоксацину, ципрофлоксацину, левофлоксацину, ломефлоксацину, пефлоксацину, пара-аминосалицилової кислоти (ПАСК) [наказ МОЗ України «Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції» № 45 від 06.02.2002 р.]. Дослідження проводили згідно вимог комісії біоетики ОДМУ (протокол № 19А від 26 січня 2007 р.).

У ході досліджень були проведені ретельний аналіз і співставлення даних лабораторної (бактеріологічної) служби з медичними картками хворих після їх виписки з ООКПТЛ. Показники медикаментозної резистентності, поширеності геннихмутацій, що пов’язані з медикаментозною резистентністю, порівнювались з показниками попередніх років.

Для вивчення резистентності штамів M. tuberculosis за допомогою мультиплексної алель-специфічної полімеразно-ланцюгової реакції (МАС-ПЛР) були обрані зразки 107 культур, виділені від пацієнтів ООКПТЛ [Mokrousov I. et al., 2002; 2003]. Виділення ДНК проводилось в бактеріологічній лабораторії ООКПТЛ з використанням хлороформу та центрифугування [Бажора Ю. И. и соавт., 2005].

Виявлення медикаментозної резистентності до ізоніазиду проводили шляхом визначення мутантних послідовностей в кодоні 315 гена katG за допомогою 3-ох праймерів; резистентності до рифампіцину - за допомогою визначення мутантних послідовностей в кодонах 516, 526, 531 гена rpoB з використанням відповідних 3-ох внутрішніх прямих праймерів і 1-го зворотного праймеру; резистентності до етамбутолу – шляхом визначення мутацій 1-го та 3-го нуклеотидів кодону 306 гена embB за допомогою 4-ох внутрішніх та 2-ох зовнішніх праймерів.

Для визначення питання про приналежність певного штаму M.tuberculosis до родини Beijing також використовували ПЛР [Banu S. еt al., 2004]. Методика мала на меті виявлення інсерційного фрагменту IS6110 в міжгенному регіоні  dnaA-dnaN, що є характерною рисою родини Beijing, за допомогою 2-ох праймерів.

Для генотипування збудника туберкульозу було проведено дослідження   6-ти локусів, що були найбільш поліморфними для M.tuberculosis (MIRU10, MIRU26, MIRU31, MIRU39, MIRU40 та ETR А), методом ПЛР із залученням відповідних праймерів [Supply P. et al., 2000].

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програмного пакету Microsoft Excel з використанням ч² критерію [Флетчер Р. и соавт., 1998].

Результати дослідження. Рівень медикаментозної резистентності збудника туберкульозу до протитуберкульозних препаратів в Одеському регіоні. Частота первинної резистентності до препаратів І ряду була найнижчою у піразинаміду – 22,2 % і найвищою у стрептоміцину і рифампіцину – 59,3 і 61,1 % відповідно (табл. 1). Резистентність до етамбутолу і ізоніазиду в цій категорії хворих склала 57,4 і 35,2 %; лише 9,3 % культур були чутливими до всіх п’яти препаратів І ряду, водночас 22,2 % були мультирезистентними (одночасно резистентні до ізоніазиду і рифампіцину) і 5,6 % були нечутливими до всіх п’яти препаратів І ряду. 

Показники вторинної резистентності культур M.tuberculosis до препаратів І ряду були найнижчими для піразинаміду – 42,9 % і найвищими для рифампіцину – 80,6 %. Резистентність до ізоніазиду, етамбутолу і стрептоміцину відзначалась у 68,2-72,9 % випадків; тільки 5,9 % культур зберігали чутливість до всіх препаратів І ряду. Натомість 31,2 % культур були резистентними до всього І ряду, а 64,1 % культур – мультирезистентними