ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ДОЦІЛЬНОСТІ СТВОРЕННЯ НОВОГО ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ НА ОСНОВІ ЕКСТРАКТУ З ШИШОК ХМЕЛЮ ЗВИЧАЙНОГО ДЛЯ КОРЕКЦІЇ ВАГІНІТІВ : ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЦЕЛЕСООБРАЗНОСТИ СОЗДАНИЕ НОВОГО лекарственных средств на основе Экстракт из шишек хмеля ДЛЯ КОРРЕКЦИИ вагинит

summary

Об'єкти та методи дослідження. Об’єктами експериментальних досліджень стали водний екстракт з шишок хмелю звичайного (ЕШХ)  та супозиторії на його основі. До складу ЕШХ входить комплекс біологічно активних речовин, представлений, головним чином, поліфенолами (складовими яких є фітоестрогени), хмільовими кислотами, а також вітамінами.

Експериментальні дослідження проводили в лабораторії морфо-функціональних досліджень при кафедрі біології, фізіології та анатомії людини НФаУ, яка сертифікована НААУ (атестат № 2Н502, 2006 р.) та ЦНДЛ НФаУ. Екперименти були проведені у відповідності до вимог комісії з біоетики НФаУ та „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).

  Досліди виконано на 309 безпородних білих щурах масою 150-220 г, 126 мишах масою 20-30 г та 15 мурчаках масою 300-330 г. Тварин утримували в стандартних умовах на збалансованому харчуванні у віварії ЦНДЛ НФаУ, обладнаному відповідно до санітарних норм.

Скринінгові дослідження з метою визначення умовнотерапевтичної дози ЕШХ були проведені на моделі гострого ексудативного запалення -  карагенінового набряку лапи у мишей та щурів (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

З метою уточнення механізму протизапальної дії проводили вивчення антиексудативної активності ЕШХ в умовах гострого запалення, викликаного дією формаліну та зимозану. ЕШХ вводили в умовнотерапевтичній дозі 5мг/кг, яка була визначена у попередніх дослідах. В якості препаратів порівняння були використані альтан у дозі 1 мг/кг, вольтарен у дозі 8 та 3,8 мг/кг (відповідно для щурів та мишей) (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Лікувальні засоби, що застосовуються у терапії вагінітів, поряд з іншими видами фармакологічної активності, повинні зменшувати пошкоджуючий вплив патогенного чинника та підвищувати резистентність слизової оболонки піхви (СОП). Це стало підгрунтям для вивчення антиальтеративної активності  ЕШХ на моделі гострого асептичного запалення шкіри та підшкірної клітковини у щурів, викликаного введенням оцтової кислоти (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

 Через те, що вагініти супроводжуються запаленням та дуже часто дегенеративними змінами слизової оболонки піхви (СОП), доцільним було вивчення впливу ЕШХ на процеси репарації при експериментальних пошкодженнях слизових оболонок. За для цього було використано гостре ураження шлунку спирто-преднізолоновою сумішшю (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

 Вивчення репаративної активності ЕШХ також проводили на моделі «лінійних різаних ран» (Хаджай Л.И., 1983; Кочнєв О.В., Ісаєв В.А., 1994). Через те, що одним із визначальних факторів швидкості репаративної регенерації є білковий обмін, проводили визначення вмісту загального білка в сироватці крові (Камишніков В.С., 2000).  Для оцінки впливу ЕШХ на  перебіг пластичних процесів на моделі «лінійних різаних ран» у щурів визначали концентрацію ДНК та РНК в гомогенаті шкіри ушкодженої ділянки (Спирин А.С., 1958).  В якості референс-препарату при вивченні антиальтеративної та репаративної дії субстанції ЕШХ був використаний препарат альтан у дозі 1 мг/кг.

Вивчення анальгетичної дії ЕШХ проводили на моделі «оцтовокислих корчів» у мишей (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001). Як препарат порівняння був використаний вольтарен у дозі 3,8 мг/кг.

Антиоксидантну та антицитолітичну активність ЕШХ вивчали на моделі гострого ураження печінки тетрахлорметаном (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001). Висновок про виразність антиоксидантної дії робили за вмістом у тканині печінки продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) – ТБК – активних продуктів (ТБК-АП), дієнових кон’югатів (ДК) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977). Стан антиоксидантної системи (АОС) оцінювали за вмістом відновленого глутатіону (GSH) (Beutler E.D. at.al., 1963). У сироватці крові визначали активність маркерного ферменту цитолізу - аланінамінотрансферази (АлАТ) (Камишніков В.С., 2000). В якості препарату порівняння використовували гепатопротектор рослинного походження силібор у дозі 25 мг/кг.

Мембраностабілізувальні властивості ЕШХ у порівнянні з альтаном вивчали на моделі спонтанної перекисної деструкції мембран еритроцитів за методом  Jager F.C. (Вороніна Л.М. та співавт.,1996).

Антимікробну активність ЕШХ вивчали на кафедрі мікробіології НФаУ під керівництвом проф. Дикого І.Л. методом дифузії в агар у модифікації «колодязів» (ДФУ, 2001; Волянський Ю.Л., 2004).

Метою наступного етапу дослідження стало вивчення ефективності застосування вагінальних супозиторіїв на основі ЕШХ у дозі 5 мг/кг в умовах експериментальних вагінітів у порівнянні з супозиторіями з обліпиховою олією у дозі 17,64 мг/кг, яка була перерахована з терапевтичної дози для людини (Рыболовлев Ю.Р. и соавт., 1979).

Вивчення терапевтичної ефективності супозиторіїв з ЕШХ проводили на моделі «механічного» вагініту у щурів (Дроговоз С.М., 2003). Досліджуваний засіб вводили у дозі 5 мг/кг в лікувальному режимі: одноразово, щодоби  протягом 5-ти діб після скарифікування СОП. Висновок про виразність лікувальної дії робили за даними макроскопічного обстеження СОП (площа ураження, виразність запального процесу), динамікою маси тіла та загальним станом тварин. Оцінку протизапальної активності супозиторіїв з ЕШХ проводили наприкінці досліду за динамікою показників периферичної крові у щурів ( швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ), гемоглобін, кількість еритроцитів та лейкоцитів, лейкоцитарна формула) (Камишніков В.С., 2000).

Ефективність супозиторіїв з ЕШХ вивчали також на моделі формалінового вагініту у щурів (Малоштан Л.М, Гладченко О.М., Уланова В.А., 2007). Досліджуваний засіб вводили у дозі 5 мг/кг в лікувально-профілактичному режимі: одноразово, щодоби  протягом 3-х діб до та протягом 7-ми діб після введення формаліну. Терапевтичну ефективність супозиторіїв з ЕШХ оцінювали за макроскопічними змінами СОП. Динаміку показників периферичної крові у щурів оцінювали аналогічно моделі «механічного» вагініту на 3-у та 7-у добу після введення формаліну. З метою детальнішого вивчення лікувальної дії супозиторіїв з ЕШХ проводили визначення показників, які характеризують інтенсивність процесів ПОЛ та стан АОС (ТБК-АП, ДК і GSH) у тканині печінки та активність АлАТ (маркер цитолізу) у сироватці крові. Морфоструктуру зрізів СОП вивчали на базі ЦНДЛ НФаУ під керівництвом професора Яковлєвої Л.В. за допомогою стандартних методів світлової мікроскопії (Меркулов Г.А., 1969; Волкова О.В., 1971).

Вивчення гострої токсичності з розрахунком середньолетальних доз ЕШХ при одноразовому внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введенні проводили за методом Пастушенко Т.В. та співавт. (1978) на мишах та щурах. Ступінь токсичності визначали за класифікацією Сидорова К.К. (1973).

Місцевоподразнювальну дію субстанції ЕШХ вивчали згідно методики (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Одержаний фактичний матеріал оброблений методами параметричної та непараметричної статистики (Лапач С.М. та співавт., 2001; Реброва О.Ю., 2006).

Результати досліджень та їх обговорення.

На початковому етапі роботи проведені скринінгові дослідження протизапальної активності ЕШХ в діапазоні доз від 1 до 50 мг/кг на моделі гострого ексудативного запалення, викликаного введенням карагеніну на мишах та щурах, в ході яких було здійснено порівняльне вивчення антиексудативних властивостей досліджуваної субстанції та визначення умовнотерапевтичної дози.

Встановлено, що ЕШХ  виявляє виразні антиексудативні властивості в дозах 5, 10, 25 та 50 мг/кг, та помірно виражені – у дозі 1 мг/кг.

 Доведено, що найвищій гальмівний вплив на розвиток ексудативного запалення ЕШХ виявляє в дозі 5 мг/кг, хоча і поступається препарату порівняння вольтарену. Зазначена доза була обрана для проведення подальших досліджень як умовнотерапевтична.

 Результати проведених досліджень свідчать про здатність досліджуваного екстракту пригнічувати біосинтез простагландинів, оскільки на третю годину експерименту ЕШХ  у дозі 5 мг/кг зменшував набряк ураженої кінцівки на 53,95% в дослідах на мишах та 50,89% в дослідах на щурах.

З метою з’ясування впливу ЕШХ у дозі 5 мг/кг на активність ліпооксигеназної системи та здатність до стабілізації мембран клітин проведено вивчення антиексудативної активності ЕШХ в умовах гострого запалення, викликаного зимозаном та формаліном (рис. 1).

ЕШХ у дозі 5 мг/кг виявив високу антиексудативну активність на моделі зимозанового набряку стопи у щурів. Досліджуваний екстракт зменшував виразність набряку через 0,5 години після введення 2% суспензії зимозану на 48,2%. Враховуючи той факт, що на ранніх етапах зимозанового запалення ключову роль відіграє активація ліпооксигеназної системи та  утворення лейкотриєнів, можна зробити висновок про наявність у ЕШХ антилейкотриєнових властивостей (рис. 1).

Встановлено, що ЕШХ виявляв також достатньо виражену протизапальну дію на моделі формалінового набряку: введення  ЕШХ у дозі 5 мг/кг супроводжувалось зменшенням набряку на 44,77% порівняно з групою контрольної патології. За виразністю антиексудативної дії в умовах формалінового набряку ЕШХ не поступається референс-препаратам вольтарену (52,82 %)  та альтану (39,32 %) (рис. 1).

Дослідження впливу ЕШХ на перебіг альтеративної запальної реакції на моделі асептичного запалення шкіри та підшкірної клітковини у щурів показало, що ЕШХ у дозі 5мг/кг при тривалому застосуванні чинить антиальтеративну дію та виявляє перевагу над препаратом порівняння альтаном у дозі 1 мг/кг. Повне загоєння ран при застосуванні ЕШХ спостерігалось на 19-ту добу лікування, в той час як при застосуванні альтана це відбувалося на 21-у добу лікування.

Наступним кроком наших досліджень стало вивчення репаративної активності ЕШХ.