Влияние in vitro пептидогликанов и липополисахаридов на секреторную, метаболическую активность и апоптоз нейтрофилов и моноцитов периферической крови : Вплив in vitro пептидогліканів та ліпополісахаридів на секреторну, метаболічну активність та апоптоз нейтрофілів і моноцитів периферійної крові

summary

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми дисертаційного дослідження, сформульовано мету, завдання, об’єкт, предмет та методи дослідження. Висвітлено наукову новизну, теоретичне та практичне значення роботи. Наведені дані про особистий внесок, апробацію, впровадження результатів дослідження, структуру дисертації.

В першому розділі, який складається з двох підрозділів, наведений аналітичний огляд наявних літературних даних щодо впливу мікроорганізмів на секреторну активність, метаболізм і апоптоз нейтрофілів і моноцитів in vitro.

Матеріал і методи дослідження. Нейтрофіли (120 культур) та моноцити (110 культур) були виділені з периферійної крові 40 практично здорових донорів-чоловіків віком від 20 до 24 років за допомогою центрифугування на градієнті фіколу-верографіну за H.R. Recalde (1994). Роботу виконували у відповідності до існуючих біоетичних норм. ПГН одержували з клітинних стінок S. intermedius за методом P.K. Peterson і ін. (1978). ЛПС одержували з клітинних стінок H. influenzae водно-феноловою екстракцією. ЛПС та ПГН отримували з культур бактерій, ізольованих від 20 дітей 7-10 років, хворих на хронічні синусити у стадії загострення, які находились на стаціонарному лікуванні у Луганській міській багатопрофільній дитячій лікарні № 3 у 2004-2005 рр. Вивчення впливу на нейтрофіли і моноцити ПГН та ЛПС проводили при їх концентрації 10, 50 та 100 мкг/мл в тест-середовищі протягом 6, 12 та 24 год. Інтактні клітини не контактували з ЛПС та ПГН.

Визначення вмісту ІЛ-1β, ІЛ-6, ІЛ-8 та ФНП-α проводили імуноферментним методом, вмісту циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ) – радіоімунним методом (в 1 млн. клітин). Визначення кількості клітин зі специфічними маркерами апоптозу проводили методом непрямої імунної флуоресценції з використанням моноклональних антитіл CD95 та CD38 (попередньо верифікацію апоптозу проводили методом проточної цитометрії та морфологічним методом). Розраховували індекс апоптозу (ІА) як кількість клітин с ознаками апоптозу на 100 клітин у зразку (%). Характер виявлених змін був проаналізований з використанням варіаційної статистики на ЕОМ.

Вплив ЛПС та ПГН на апоптоз нейтрофілів та моноцитів in vitro. При оцінці апоптозу клітин морфологічним методом встановлено, що ДНК в ядрах клітин, які не вступили на шлях апоптозу, фарбувалось у зелений колір, а РНК в ядерцях та цитоплазмі – у червоний. При реалізації апоптозної програми зелений колір проникав до цитоплазми, а фрагментоване ядро мало вигляд зелених кульок. Більшість клітин, які загинули, мали морфологічні зміни, характерні для апоптозу. Загибель клітин за механізмом апоптозу була підтверджена з допомогою цитофлуориметричного аналізу, який дозволяє виявити частку гіподиплоїдних клітин.

Вираховування ІА інтактних нейтрофілів та моноцитів протягом 24 год. дозволило виявити наступну залежність: зі збільшенням терміну культивування клітин кількість нейтрофілів та моноцитів, які вступили на шлях апоптозу, збільшувалась, а значення ІА зростало. Зокрема, вихідний ІА інтактних нейтрофілів (0 год. культивування) склав 4,3±0,2 %, значення ІА на 6 год. склало 5,8±0,3 %, на 12 год. – 8,2±0,4 %, на 24 год. – 12,4±0,6 %. Для інтактних моноцитів аналогічні значення ІА склали в 0, 6, 12 та 24 год. досліду, відповідно, 2,7±0,14 %, 3,5±0,18 %, 4,3±0,21 % та 5,8±0,3 %.

Додавання до середовища культивування ЛПС та ПГН помітно посилювало апоптоз нейтрофілів і моноцитів in vitro. Ступінь виразності апоптогенної дії ЛПС та ПГН залежав від їх концентрацій та тривалості контакту з клітинами-мішенями. Найбільшу апоптогенну дію мали ЛПС та ПГН в концентрації 100 мкг/мл, найменшу – в концентрації 10 мкг/мл. Так, ЛПС в дозі 10 мкг/мл при взаємодії з нейтрофілами не викликали значущого збільшення ІА протягом 24 год. контакту порівняно з інтактними клітинами, але збільшували кількість клітин, які несли на цитоплазматичних мембранах рецептори до специфічних і неспецифічних маркерів апоптозу CD38 та CD95. Зокрема, до 24 год. культивування нейтрофілів з 10 мкг/мл ЛПС значення ІА перевищило показник інтактних клітин в 1,1 разу і склало 13,7±0,7 % (р>0,05), а кількість CD38- та CD95-позитивних нейтрофілів збільшилась у 1,4 рази (р<0,001 в обох випадках).

Також було відзначено, що нейтрофіли були значно більш чутливими до апоптогенної дії ЛПС та ПГН, ніж моноцити. Так, контакт моноцитів з 10 мкг/мл ЛПС до 24 год. досліду супроводжувався збільшенням значення ІА в 1,19 разу (воно склало 6,9±0,35 %). Приріст кількості CD38-позитивних моноцитів до 24 год. склав 1,46 разу, CD95-позитивних клітин 1,3 разу.

Отримані нами дані не суперечать результатам досліджень V. D’Intini та ін. (2003), які при вивченні інтенсивності апоптозу in vitro моноцитів периферійної крові хронічних уремічних хворих показали, що клітини пацієнтів, які отримували гемодіаліз, мали більш високе значення ІА порівняно з моноцитами пацієнтів, які отримували перитонеальний діаліз, та пацієнтів з переддіалізною стадією хронічної ниркової недостатності.

Вплив ЛПС та ПГН на секреторну активність нейтрофілів та моноцитів in vitro. Культивування інтактних нейтрофілів і моноцитів протягом 6 год. супроводжувалось вірогідним збільшенням концентрації ІЛ-1β порівняно з вихідним рівнем (до, відповідно, 4,15±0,21 пг/мл та 5,75±0,29 пг/мл). До 12 год. досліду рівні ІЛ-1β в культурах нейтрофілів та моноцитів збільшились, відповідно, в 1,51 та в 1,53 разу порівняно з показниками, зареєстрованими на 6 год. досліду (та склали, відповідно, 6,27±0,31 пг/мл та 8,79±0,44пг/мл), до 24 год. приріст концентрацій ІЛ-1β склав проти показника, зареєстрованого на 12 год., 1,99 разу для нейтрофілів (12,45±0,62 пг/мл) та 1,96 разу для моноцитів (17,25±0,85 пг/мл). Таким чином, секреція моноцитами ІЛ-1β вірогідно перевищувала таку для нейтрофілів у всіх часових точках обліку (р<0,001). Більш інтенсивно, ніж нейтрофіли, інтактні моноцити секретували інші медіатори. Слід також відзначити, що секреція ІЛ-1β як нейтрофілами, так і моноцитами суттєво переважала над секрецією ІЛ-6, ІЛ-8 та ФНП-α.

Внесення до середовищ культивування нейтрофілів та моноцитів ЛПС та ПГН сприяло суттєвому збільшенню секреції медіаторів даними клітинами. При цьому стимулюючий ефект структурних компонентів бактерій залежав від їх концентрації, видової приналежності та від часу контакту з клітинами.

Контакт нейтрофілів з ЛПС в концентрації 10 мкг/мл викликав найменше, порівняно з більш високими дозами ЛПС, посилення секреції медіаторів, рівень яких прогресивно збільшувався протягом часу. Зокрема, рівень секреції ІЛ-1β нейтрофілами на 6 год. взаємодії з 10 мкг/мл ЛПС склав 24,7±1,24 пг/мл, на 12 год. – 36,4±1,8 пг/мл, на 24 год. – 78,8±3,82 пг/мл.

Рівень секреції медіаторів моноцитами під впливом 10 мкг/мл ЛПС переважав над рівнем секреції нейтрофілів при інших однакових умовах експерименту. Зокрема, рівень секреції ІЛ-1β моноцитами на 6 год. взаємодії з 10 мкг/мл ЛПС склав 31,7±1,59 пг/мл, на 12 год. – 53,4±2,67 пг/мл, на 24 год. – 101,1±5,06 пг/мл.

Збільшення діючої концентрації ЛПС до 50 мкг/мл супроводжувалось збільшенням секреції медіаторів нейтрофілами та моноцитами порівняно з такою при використанні 10 мкг/мл ЛПС. При цьому також, як і при використанні 10 мкг/мл ЛПС, секреція ІЛ-1β переважала над секрецією інших досліджуваних медіаторів, а секреція ІЛ-8 була найменш інтенсивною.

Найбільший стимулюючий секрецію медіаторів потенціал мали ЛПС в концентрації 100 мкг/мл. Зокрема, на 6 год. досліду рівень ІЛ-6 перевищував показник інтактних нейтрофілів у 21,1 разу, на 12 та 24 год. – у 19,88 та 21,5 разу. Для рівня ІЛ-8 аналогічні зміни склали на 6, 12 та 24 год. досліду, відповідно, 18,4, 18,3 та 18,1 разу, для ФНП-α – 23,1, 24,5 та 24,3 разу.

Контакт нейтрофілів та моноцитів з ПГН також супроводжувався посиленням секреторної активності клітин по мірі збільшення часу їх взаємодії, однак порівняно з таким в дослідах з ЛПС воно було менш виразним.

Отримані нами дані узгоджуються з результатами досліджень Т.В. Левченко (2007, 2008), яка показала, що контакт in vitro моноцитів периферійної крові людини з ЛПС та ПГН супроводжувався посиленням секреції клітинами ІЛ-1β, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-α, ФНП-β та α-інтерферону. Найбільш інтенсивно секрецію вказаних медіаторів стимулювали ЛПС в діючий концентрації 100 пг/мл при 96 год. контакту з моноцитами.

Вплив ЛПС та ПГН на вміст циклічних нуклеотидів у загальних популяціях нейтрофілів та моноцитів in vitro. Внутрішньоклітинні ефекти багатьох ендогенних та екзогенних біологічно активних речовин реалізуються при участі систем «вторинних» посередників, до яких належить система циклічних нуклеотидів. У нинішній час доведено, що один з найбільш важливих механізмів, який є посередником фізіологічних і біохімічних ефектів багатьох медіаторів, оснований на стимуляції утворення цАМФ та цГМФ, функцією яких є трансформація міжклітинних взаємодій у внутрішньоклітинні.

Нами встановлено, що 1 млн. інтактних нейтрофілів з загальної популяції при 0 год. культивування містили 2,73±0,22 пкмоль цАМФ, 2,95±0,25 пкмоль цГМФ, а значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ для даних клітин склало 0,9±0,08 у.о. Для 1 млн. інтактних моноцитів аналогічні значення склали, відповідно, 2,5±0,2 пкмоль, 3,43±0,27 пкмоль та 0,72±0,06 у.о.

Зі збільшенням часу культивування інтактних нейтрофілів вміст цАМФ прогресивно збільшувався та склав на 6 год. 2,95±0,2, на 12 год. – 3,2±0,22, на 24 год. – 3,4±0,24 (в пкмолях на 1 млн. клітин). Зміст цГМФ в даних клітинах зменшувався та складав, на 6, 12 та 24 год. досліду, відповідно, 2,87±0,2, 2,65±0,19 та 2,5±0,18(в пкмолях на 1 млн. клітин). Для інтактних моноцитів значення цАМФ на 6, 12 та 24 год. культивування in vitro склали, відповідно 2,54±0,13, 2,76±0,14 і 2,91±0,15, значення цГМФ – відповідно, 3,28±0,16, 3,11±0,16 та 3,02±0,15 (в пкмолях на 1 млн. клітин).

Встановлено, що найменш суттєво на вміст цАМФ та цГМФ, а також на їх баланс впливали ЛПС та ПГН в концентрації 10 мкг/мл. Під впливом вказаної концентрації ЛПС і ПГН вірогідних змін внутрішньоклітинного вмісту циклічних нуклеотидів не виявлено. Вірогідний дисбаланс (р<0,05) в системі цАМФ/цГМФ в загальній популяції нейтрофілів при їх контакті з 10 мкг/мл ЛПС був виявлений тільки на 24 год. досліду (значення коефіцієнту цАМФ/цГМФ склало 1,18±0,08 у.о.). Під впливом 10 мкг/мл ПГН вірогідні зміни значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ нейтрофілів реєстрували на 12 та 24 год. експерименту, що свідчило про більш активний вплив ПГН на нейтрофіли. Разом з цим, вірогідної відмінності між значеннями індексу цАМФ/цГМФ в загальних популяціях нейтрофілів, які контактували з 10 мкг/мл ЛПС та ПГН, не виявлено. Збільшення діючих концентрацій ЛПС та ПГН до 50 та 100 мкг/мл супроводжувалось посиленням їх впливу на внутрішньоклітинний вміст циклічних нуклеотидів в нейтрофілах.

Нами також було встановлено, що система циклічних нуклеотидів у моноцитах була більш стійкою до дії різних концентрацій ЛПС та ПГН, ніж в нейтрофілах. Це мало прояв у менш вираженому збільшенні внутрішньоклітинного вмісту цАМФ і у менш вираженому дисбалансі в системі цАМФ/цГМФ.

Це не суперечить даним, отриманим Г.В. Миргородською (2008), яка показала, що дія на моноцити та нейтрофіли периферійної крові людини in vitro ПГН та ЛПС в концентраціях 100 та 200 мкг/мл супроводжувалась розвитком дисбалансу в системі циклічних нуклеотидів, що мало прояв у зниженні внутрішньоклітинної концентрації цГМФ, а також у збільшенні концентрації цАМФ та значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ. Порушення в системі циклічних нуклеотидів були більш виражені при контакті клітин з ЛПС, особливо моноцитів.

Вплив ЛПС та ПГН на вміст циклічних нуклеотидів у CD95-позитивних та CD95-негативних нейтрофілах та моноцитах in vitro. Стан системи циклічних нуклеотидів у CD95-позитивних нейтрофілах та моноцитах при їх контакті з ЛПС та ПГН характеризувався збільшенням концентрації цАМФ та зниженням вмісту цГМФ, що супроводжувалось збільшенням значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ. Вказані зміни були найбільш виражені у CD95-позитивних нейтрофілах та моноцитах, які контактували з 100 мкг/мл ЛПС протягом 24 год. Зокрема, вміст цАМФ в CD95-позитивних нейтрофілах за даних умов досліду склав 4,1±0,29 пкмоль на 1 млн. клітин, цГМФ – 1,64±0,11 пкмоль на 1 млн. клітин, значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ – 1,64±0,11 у.о., для CD95-позитивних моноцитів ці показники склали 3,52±0,18 та 2,51±0,13 пкмоль на 1 млн. клітин та 1,4±0,07 у.о. відповідно.

Навпаки, у CD95-негативних нейтрофілах та моноцитах зміни в системі циклічних нуклеотидів під впливом ЛПС та ПГН були діаметрально протилежними таким, зареєстрованим в популяціях CD95-позитивних клітин. По мірі зростання діючих на клітини концентрацій ЛПС та ПГН спостерігали зниження внутрішньоклітинного вмісту цАМФ та збільшення вмісту цГМФ, що супроводжувалось зменшенням значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ. Вказані зміни в системі циклічних нуклеотидів у CD95-негативних нейтрофілах та моноцитах біли найбільш виражені при їх контакті з 10 мкг/мл ЛПС та ПГН. Зокрема, при контакті CD95-негативних нейтрофілів з 10 мкг/мл ЛПС протягом 24 год. вміст цАМФ склав 2,92±0,1 пкмоль на 1 млн. клітин, цГМФ – 3,81±0,19 пкмоль на 1 млн. клітин, значення коефіцієнта цАМФ/цГМФ – 0,5±0,03 у.о., для CD95-негативних моноцитів ці показники склали 1,54±0,08 та 4,32±0,22 пкмоль на 1 млн. клітин та 0,35±0,02 у.о. відповідно.

Узагальнюючи отримані дані, слід підкреслити, що обґрунтування ролі ЛПС та ПГН у дозозалежній та специфічній стимуляції секреторної, метаболічної активності та готовності до реалізації апоптозної програми нейтрофілами і моноцитами периферійної крові in vitro дозволить розкрити нові ланки патогенезу запальних процесів бактеріальної етіології та, базуючись на цьому, розробити нові методи їх етіопатогенетичної терапії і профілактики ускладнень.

ВИСНОВКИ

В дисертації викладено теоретичне обґрунтування ролі структурних компонентів бактерій (ПГН S. intermedius та ЛПС H. influenzae) в стимуляції секреторної і метаболічної активності та апоптозу нейтрофілів і моноцитів периферійної крові здорових людей in vitro, та доведена залежність цієї ролі від концентрації ЛПС і ПГН, а також від часу експонування клітин з структурними компонентами бактерій.

1.         ЛПС та ПГН стимулюють in vitro апоптоз нейтрофілів та моноцитів периферійної крові людини, що має прояв у збільшенні як кількості клітин, які вступили на шлях апоптозу, так і клітин, які мають у фенотипі неспецифічні та специфічні маркери апоптозу – CD38 та CD95. Апоптогенний вплив на моноцити та нейтрофіли ЛПС та ПГН залежить від дози та часу взаємодії: кількість апоптуючих клітин зростає по мірі збільшення діючих концентрації ЛПС та ПГН, а також часу контакту з ними моноцитів і нейтрофілів. Найбільший рівень апоптуючих клітин зареєстрований при контакті моноцитів та нейтрофілів з 100 мкг/мл ЛПС та ПГН протягом 24 год., найменший – при контакті з 10 мкг/мл ЛПС та ПГН протягом 6 год. Моноцити є більш стійкими до апоптогенного впливу ЛПС та ПГН. Нейтрофіли є однаково чутливими до апоптогенної дії ЛПС та ПГН незалежно від концентрації останніх та часу контакту з ними, тоді як моноцити найбільш чутливі до впливу ЛПС.

2.         ЛПС та ПГН in vitro посилюють секрецію моноцитами та нейтрофілами ІЛ-1β, ІЛ-6, ІЛ-8 та ФНП-α. Вплив ЛПС та ПГН на секреторну активність моноцитів та нейтрофілів залежить від дози та часу взаємодії: найбільші рівні секреції медіаторів спостерігали через 24 год. контакту клітин з 100 мкг/мл ЛПС та ПГН, найменші – через 6 год. контакту з 10 мкг/мл ЛПС та ПГН. Стимулюючий секрецію потенціал ЛПС суттєво перевищує такий для ПГН незалежно від дози та часу дії на моноцити і нейтрофіли. Під впливом ПГН та ЛПС найбільш інтенсивно секретуються ІЛ-1β та ФНП-α, найменш інтенсивно – ІЛ-8. Секреторна активність моноцитів при стимуляції їх ЛПС та ПГН була суттєво вищою такої нейтрофілів.

3.         ЛПС та ПГН дозо- та часозалежно впливають на внутрішньоклітинний вміст цАМФ і цГМФ в загальних популяціях нейтрофілів та моноцитів, що має прояв у кількісному переважанні цАМФ над цГМФ. Найбільший дисбаланс в системі цАМФ/цГМФ в загальних популяціях нейтрофілів та моноцитів розвивається при дії на клітини 100 мкг/мл ЛПС та ПГН протягом 24 год., найменший – при дії 10 мкг/мл ЛПС та ПГН протягом 6 год. Моноцити проявляють більшу стабільність внутрішньоклітинного вмісту цАМФ та цГМФ, ніж нейтрофіли.

4.         У CD95-позитивних нейтрофілах і моноцитах, підданих впливу ЛПС і ПГН, має місце кількісне переважання цАМФ над цГМФ, тоді як у CD95-негативних клітинах спостерігають переважання цГМФ над цАМФ. Дисбаланс в системі цАМФ/цГМФ CD95-позитивних клітин посилюється по мірі збільшення діючих доз ЛПС та ПГН та тривалості їх контакту з клітинами, тоді як дисбаланс в системі цАМФ/цГМФ CD95-негативних клітин зі збільшенням діючих доз ЛПС та ПГН та тривалості їх контакту з даними клітинами зменшується.