МОРФОГЕНЕЗ СЕЛЕКТИВНОЇ ЗАГИБЕЛІ ТА ВІДНОВЛЕННЯ НЕЙРОНІВ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ПРИ ПОСТРЕАНІМАЦІЙНІЙ ЕНЦЕФАЛОПАТІЇ : МОРФОГЕНЕЗ селективной ГИБЕЛИ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ нейронов головного мозга ПРИ постреанимационной ЭНЦЕФАЛОПАТИИ

summary

Матеріал і методи досліджень. Дослідження були виконані на базі Запорізького обласного патологоанатомічного бюро та на кафедрі патологічної анатомії та судової медицини з основами права Запорізького державного медичного університету. Морфологічний аналіз змін нейронів і глії при ПРЕ проведений у головному мозку 106 померлих хворих віком від 21 до 89 років (64 чоловіки і 42 жінки), які перенесли КС тривалістю від 30 секунд до 40 хвилин або дво- п’ятикратну КС сумарною тривалістю від 7 до 60 хвилин. Середній вік померлих хворих склав 61,66±11,45 років: хворі молодого і середнього віку (21–55 років) склали 30,19% секційних спостережень, особи літнього віку (56–75 років) – 55,66%, особи старечого віку (76–89 років) – 14,15% від загальної кількості всіх секційних досліджень.

Для визначення змін нейронів в динаміці ПРП в секційних дослідженнях було виділено 9 груп: хворі, що померли через 1–12 годин після КС (22 спостереження), через 13–24 години (15 спостережень), через 25–48 годин (17 спостережень), через 3 доби (12 померлих), через 4 доби (9 померлих), через 5–7 діб (12 спостережень), через 8–14 діб (9 спостережень), через 15–30 діб (6 спостережень), через 31–127 діб (4 спостереження). Групу умовного контролю склали 5 хворих 56–72 років, що не страждали захворюваннями ЦНС і померли від гострої коронарної недостатності. Групу порівняння склали 5 хворих 45–68 років, що вмерли в стаціонарі після раптової КС і безуспішної 30-хвилинної реанімації.

У померлих хворих через 3–24 години після біологічної смерті при розтині вирізалися шматочки кори прецентральної звивини лобної долі лівої півкулі головного мозку, гіпокампа, стовбура мозку на рівні верхнього й нижнього кута ромбовидної ямки, а також кори мозочка з його нижньої оливи для нейроморфологічних, ІГХ і комп’ютерно-морфометричних досліджень.

Експериментальні дослідження виконані на 65 свійських кішках і 12 білих щурах. Для вивчення ранніх субмікроскопічних і патогістологічних змін нейронів і гліо-нейронних відношень при ПРЕ на 50 дорослих здорових безпородних свійських кішках обох статей масою від 2 до 5,5 кг під внутрішньоочеревинним наркозом тіопенталом натрію (50 мг на 1 кг маси тварини) після інтубації моделювалась зупинка серця і дихання тривалістю 5–6 хвилин за розробленою нами методикою (патент України № 28969 від 25.12.2007 р.) шляхом компресії грудної клітини надувною манжетою. Після зняття манжети проводилися непрямий масаж серця до відновлення серцевої діяльності та штучна вентиляція легенів апаратом «Малыш» (тип 265) до відновлення самостійного ритмічного дихання. Динаміка перебігу ПРП фіксувалась за баловою системою Сафара і Гурвича та за удосконаленою нами шкалою Глазго-Пітсбург. Для дослідження морфологічних змін в динаміці ПРЕ експериментальні тварини під внутрішньоочеревинним наркозом тіопенталом натрію забивалися шляхом декапітації через 1, 3, 6, 12 годин, 1, 2, 3, 6, 9, 12 діб після КС (по 5 кішок в кожній групі спостережень). Зміни у головному мозку через 30 діб після КС вивчені у 5 тварин з архівного матеріалу кафедри. Групу порівняння склали 5 кішок, яких не вдалося реанімувати після КС; контрольну групу склали 5 здорових інтактних кішок. У всіх випадках проводили патологоанатомічний розтин тварин з гістологічним дослідженням внутрішніх органів. Після декапітиції тварин для електронної мікроскопії брали ділянки кори з білою речовиною лобної області лівої півкулі та стовбура головного мозку; для світлової мікроскопії вирізали ділянки кори та білої речовини лобної області правої півкулі головного мозку, гіпокампа, стовбура мозку і мозочка.

Репаративні процеси у нейронах і гліальних клітинах головного мозку в ПРП вивчені з використанням бромдезоксиурідину у 9 лабораторних білих щурів лінії Wistar, яким моделювали КС позагрудинним кліпуванням судинного пучка серця Г-подібним гачком без торакотомії за методикою В.Г. Корпачова (1982). У ПРП щурам щодня внутрішньоочеревинно однократно вводили BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine, «Sigma-Aldrich» – Німеччина) на фізіологічному розчині з розрахунку 40 мг на 1 кг маси тварини. Через 3, 5 ,7 діб після КС щури забивалися шляхом декапітації під загальним ефірним наркозом (по 3 щури в кожній групі спостережень). Контрольну групу склали 3 інтактних білих щури, забиті під ефірним наркозом через 3 доби після щоденного однократного введення BrdU у аналогічних дозах.

Для нейроморфологічного дослідження шматочки тканини головного мозку фіксували в забуференому 10% формаліні і заливали в парафін; зрізи, виготовлені на прецизійному ротаційному мікротомі НМ 3600 («MICROM Laborgeräte GmbН» – Німеччина), фарбували гематоксиліном і еозином за стандартною методикою, а також вибірково фарбували крезил-віолетом за F. Nissl і галоціанін-хромовими галунами за L. Einarson. Гліальні клітини виявляли в заморожених зрізах завтовшки 20-30 μ, виготовлених на мікротомі НМ 500 О («MICROM Laborgeräte GmbН» – Німеччина) з фіксованих в бром-формолі шматочків мозку, які імпрегнували в золото-сулемовому розчині за Ramon-i-Cajal (для астроглії) або в аміачному розчині вуглекислого срібла за Rio-Hortega (для мікроглії). Зміни мієлінових оболонок аксонів оцінювали в препаратах, оброблених за M. Krutsau.

Для електронної мікроскопії в перші 3-5 хвилин після декапітації тварин зі зрошеного 2,5% глютаральдегідом на 0,1М фосфатному буфері мозку вилучались дрібні шматочки, які фіксували 2 години в аналогічному розчині при температурі +4°С, далі фіксували 2 години в 1% розчині OsО₄ на 0,1М фосфатному буфері, потім зневоднювали в спиртах, контрастували 2 години в 2% ураніл-ацетаті і заливали в аралдит. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомі Reichert Om43, контрастували на сіточках цитратом свинцю за E.S. Reynolds (1963) та вивчали у електронному мікроскопі ПЭМ-100.

Для ІГХ досліджень на мікротомі НМ 3600 виготовляли серійні парафінові зрізи головного мозку завтовшки 3 μ, які поміщали на адгезивні предметні скельця «Super Frost Plus» («Menzel Glaser» – Німеччина). ІГХ-визначення експресії про- та антиапоптотичних білків проводилось з використанням моноклональних антитіл Mo a-Rat Bcl-X проти білка Bcl-X_L і системи візуалізації LSAB2; Mo a-Hu CD95, APO-1/Fas проти рецептора Fas і системи візуалізації EnVision+; а також поликлональных антитіл Rb a-Hu Bax проти протеїну Bax і системи візуалізації CSA System Rabbit Link. Фагоцити імуногістохімічно визначались за допомогою моноклональних антитіл Mo a-Hu CD68 Macrophage проти поверхневого рецептора макрофагів і системи візуалізації EnVision+ (всі реактиви фірми «DAKO» – Данія). З використанням моноклональных антитіл Mo a-BrdU («Sigma-Aldrich» – США) та системи візуалізації EnVision+ («DAKO» – Данія) досліджувалось включення бромдезоксиурідину в ядра проліферуючих гліальних клітин, а також в мітохондрії при репарації ушкоджених нейронів.

На комп’ютерній системі цифрового аналізу зображення KS 200 («Kontron Elektronik» – Німеччина), інтегрованій в мікроскоп Axioplan 2 («Carl Zeiss» – Німеччина) з відеокамерою DXC-151A («Sony» – Японія), у померлих в різні терміни після КС хворих визначались зміни площі, периметру, коефіцієнту форми та оптичної щільності великих пірамідних нейронів 5-го шару кори прецентральної звивини великих півкуль мозку у гістологічних препаратах, забарвлених гематоксиліном і еозином, при чотирьохкратному вимірюванні кожного об’єкту. У експериментальних кішок у різні терміни ПРП у гістологічних препаратах, забарвлених гематоксиліном і еозином, підраховувалась кількість патологічно змінених кортикальних нейронів у 10 стандартних полях зору мікроскопа Axioplan 2 «Carl Zeiss» (об’єктив х40).

Отримані кількісні результати оброблялись методом варіаційно-статистичного аналізу середніх величин на персональному комп’ютері з процесором «Intel Core 2 Quad 6600» із використанням програмного пакета Statistica 6.1 for Windows. Обчислювалась середня арифметична величина (М), середнє квадратичне відхилення (σ) і стандартна помилка середньої арифметичної (m). Вірогідність відмінностей порівнюваних величин визначалася за допомогою критерію Стьюдента (Т). За достовірну мінімальну ймовірність розходжень приймали р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. За даними нейроморфологічних, ІГХ, електронно-мікроскопічних і комп’ютерно-морфометричних досліджень у постішемічно-реперфузійному періоді після КС в головному мозку визначався мозаїчно розподілений селективний некроз і апоптоз нейронів, а також загибель нервових і гліальних клітин в ділянках невідновленої капілярної гемомікроцируляції, які мали певні структурні відмінності в динаміці ПРП.

Патогістологічні і електронно-мікроскопічні дослідження головного мозку показали, що в перші години ПРП початкові ішемічні зміни нейронів проявлялись нерівномірним вакуолеподібним набряканням мітохондрій з редукцією і руйнуванням крист. За даними комп’ютерної морфометрії ішемічно змінені кортикальні нейрони в цей термін ПРЕ мали площу 276,4±12,6 мкм², периметр – 68,1±3,4 мкм, коефіцієнт форми – 0,79±0,03, оптичну щільність – 131,3±6,2 умовних одиниць.

Наприкінці 1-ї доби після КС в головному мозку переважали ішемічно ущільненні і хроматолітично змінені нейрони. Цитоплазма хроматолітично змінених нейронів була значно просвітленою, з майже відсутньою речовиною Нісля, ядра таких нейронів були набряклими, просвітленими, з пилоподібно-дрібнозернистим хроматином і ексцентрично розташованим дрібним ядерцем. В ішемічно ущільнених нейронах визначалось рівномірно зменшене, базофільне та гіперхромне ядро без ядерця, з гомогенним і ущільненим хроматином; зменшена цитоплазма була гомогенно еозинофільною внаслідок повної редукції хроматофільної речовини, іноді спостерігались її залишки у вигляді слабоконтурних смуг або брилок. За даними комп’ютерної морфометрії наприкінці 1-ї доби після перенесеної КС ішемічно набряклі або хроматолітично змінені нервові клітини, а також ішемічно ущільнені гіперхромні нейрони мали відповідно такі параметри: площа складала 427,2±23,4 і 162,5±7,8 мкм², периметр – 108,4±5,1 і 53,1±2,5 мкм, коефіцієнт форми – 0,89±0,05 і 0,75±0,03 та оптична щільність – 147,4±7,4 і 127,6±6,2 умовних одиниць. Патологічно змінені нейрони були мозаїчно розподілені між структурно збереженими клітинами в нервовій тканині, але частіше вони спостерігались в зонах невідновленої гемомікроциркуляції.

Ушкодження мітохондрій протягом перших 3-х діб ПРП призводило до активації внутрішніх мітохондріальних шляхів апоптозу нейронів, можливим його активатором могли бути також іони кальцію і білки, вивільнені з розширених цистерн ЕПС з втраченими прикріпленими рибосомами. Встановлено, що апоптоз нейронів ЦНС активують внутрішні (Bax) мітохондріальні фактори та мембранні Fas-APO-рецептори. В цей період ІГХ методом виявлялась надекспресія проапоптотичного білка Вах у цитоплазмі кортикальних нейронів при відсутності експресії цього протеїну в поруч розташованих гліальних клітинах. Починаючи з 1-ї доби після перенесеної КС ІГХ методом виявлялась також експресія молекул CD95/Fas у цитоплазмі окремих нейронів або, рідше, – у плазматичній мембрані. Рівень експресії цього білка зростав до 3–4-ї доби після реанімації в корі головного мозку та до 5–6-ї доби – в стовбурі мозку, а потім його експресія поступово регресувала. За даними світлової мікроскопії на 3–5-й добі ПРП визначався розповсюджений апоптоз нейронів гіпокампа, більшість яких є глутамат-чутливими клітинами (Portera-Cailleau C. et al., 1997; MacManus J.P. et al., 1997; Gwag B.J. et al., 2002), що свідчило про розвиток у хворих після клінічної смерті також ексайтоксичного апоптозу глутамат-чутливих нейронів ЦНС.

Встановлено, що найбільш раннім ультраструктурним проявом патогенно-індукованого апоптозу нейрона було ущільнення каріоплазми ядра з крупним ядерцем і агрегація хроматину у великі конгломерати біля каріолеми (маргінація хроматину), при цьому визначались брунькоподібні випинання ядра в цитоплазму з набряклими мітохондріями і збереженими іншими органелами. Надалі спостерігався каріопікноз та каріорексис на гіперхромні «ядерні апоптотичні тільця», фрагментація нервових клітин і фагоцитоз цих фрагментів макрофагами. За літературними даними (White B.C. et al., 2000; Wang K.K.W., 2002; Stefanis L., 2005) провідну роль в саморозборці клітин при апоптозі відіграє програмована активація каспаз. Апоптоз нейронів гіпокампа, стовбура мозку, кори великих півкуль і кори мозочка спостерігався протягом першого тижня після КС. Незважаючи на дані ІГХ щодо поширеної в ПРП експресії Bax і CD95/Fas в значній кількості клітин, дані світлової і електронної мікроскопії показали, що далеко не всі ці клітини гинуть шляхом апоптозу. Відомо (Lipton P., 1999), що надекспресія Вах у цитоплазмі нейрона вважається провісником його загибелі, хоча Вах-індукований апоптоз може блокуватися одночасною експресією Всl-X_L (Pashen W., 2004). В головному мозку хворих, померлих через 2–3 доби після реанімації, на тлі загибелі більшості нейронів експресія Bcl-X_L визначалась у цитоплазмі поодиноких нейронів, що вижили. ІГХ-виявлення експресії проапоптотичних і антиапоптотичних маркерів у головному мозку хворих у ПРП дає можливість прогнозувати лише вірогідність загибелі або виживання нейронів, але не визначає конкретний тип клітинної загибелі: апоптоз, каріоцитолізис або коагуляційний некроз. Найбільш вірогідною долею ішемічно ушкоджених нейронів, враховуючи дефіцит енергії в ПРП, є загибель шляхом коагуляційного некрозу і каріоцитолізису, або рання активація шляхів виживання за допомогою гліальних клітин-сателітів.

Протягом 2–3–8-ї доби після реанімації при мікроскопії у всіх відділах головного мозку визначався каріоцитолізис і коагуляційний некроз нервових клітин. В ранній фазі розвитку каріоцитолізису нейрона при електронній мікроскопії визначалось ішемічне набрякання цитозолю, набрякання ядра, значна вакуолізація мітохондрій, різке розширення порожнин ЕПС, деструкція аксо-дендритних і аксо-соматичних синапсів. Далі спостерігалось руйнування ядерця і ядерного хроматину (кариолізис), паралельно визначалась редукція майже всіх рибосом і набрякання цистерн ЕПС, і у фіналі – лізис органел і компонентів цитоскелета з спустошенням цитоплазми (цитолізис), який за даними М. Artal-Sanz M. et. al. (2005) відбувається внаслідок міграції лізосомальних гідролаз. Нейрони з ознаками каріоцитолізису мали наступні комп’ютерно-морфометричні параметри: площу 1002,8±42,5 мкм², периметр – 122,3±5,8 мкм, коефіцієнт форми – 0,93±0,05 та оптичну щільність – 175,7±6,4 умовних одиниць. При світловій мікроскопії загиблий шляхом каріоцитолізису нейрон мав вигляд безструктурної «клітини-тіні» з розпливчастими контурами ядерної і плазматичної мембрани.

Протягом перших 3-х діб ПРП ішемічний коагуляційний некроз і апоптоз нейронів в головному мозку мали майже подібні мікроскопічні і ультраструктурні ознаки. У цьому періоді в усіх апоптотично і пренекротично ущільнених нейронах визначався каріопікноз із глибчастою конденсацією і маргінацією хроматину, набрякання мітохондрій зі значною редукцією крист, розширення вакуолей комплексу Гольджі і цистерн гранулярної ЕПС без прикріплених рибосом, а також виявлялись зруйновані аксо-дендритні і аксо-соматичні синапси. Цитоплазма таких нейронів відрізнялась підвищеною осміофілією нуклеопротеїдів і дезінтегрованих рибосом; підвищеною електронною щільністю білків цитозолю, аксоплазми і дендроплазми. Ущільнені і зменшені нейрони були оточені розширеними відростками астроцитів і макрофагів. Такі структурні зміни могли бути однією з фаз апоптозу нейрона напередодні його дезінтеграції каспазами, а могли бути також проявами розвитку коагуляційного ішемічного некрозу нервової клітини. За даними комп’ютерної морфометрії такі нейрони мали площу – 139,2±6,8 мкм², периметр – 48,1±2,3 мкм, коефіцієнт форми – 0,83±0,04 та оптичну щільність – 115,5±4,9 умовних одиниць.

За даними електронної мікроскопії, на початку розвитку ішемічного коагуляційного некрозу нейрона, крім набрякання мітохондрій, спостерігалась локальна коагуляція і гіперосміофілія мембран мікротрубочок, крист мітохондрій і цистерн ЕПС, а також коагуляція і дрібнобрильчата конденсація щільного хроматину ядра. Протягом доби відбувалась редукція ядерця, рибосоми від’єднувались від цистерн гранулярної ЕПС, значно розширювались цистерни каріотеки і ЕПС, що в сукупності свідчило про припинення процесів біосинтезу в нейроні при його некрозі. На відміну від патогенно-індукованого апоптозу, характерною ознакою якого була збереженість ядерця в пікнотизованому ядрі з гофрованими контурами, при коагуляційному некрозі спостерігався глибокий пікноз ядра з відсутністю в ньому ядерця, у цитоплазмі зазвичай були відсутні залишки фрагментованого ядра – так звані «ядерні апоптозні тільця». Загиблий ішемічним коагуляційним некрозом нейрон визначався при світловій мікроскопії як зменшена («муміфікована») клітина з гіперхромним пікнотичним ядром без ядерця і щільною, безструктурною, еозинофільною цитоплазмою, позбавленою базофільних глибок речовини Нісля. Навколо загиблої зменшеної і гіперхромної клітини завжди спостерігався розширений «перинейрональний простір», який, за даними електронної мікроскопії, представляв собою розширені відростки астроцитів і макрофагів, що щільно оточували нейрон, позбавлений аксо-соматичних синапсів. У віддаленому після КС періоді на місці загиблих каріоцитолізисом або коагуляційним некрозом нейронів формувалися дрібні вогнища замісного гліофіброзу.

Значну роль в загибелі нервових і гліальних клітин в ранньому ПРП відігравали численні вогнища невідновленої капілярної гемомікроциркуляції, які визначались при мікроскопії в перші хвилини після реанімації у всіх відділах головного мозку. Крім цього, у хворих, померлих у віддаленому після КС періоді, в головному мозку спостерігались «свіжі» ділянки невідновленого кровотоку, які з’являлись внаслідок значного зниження системного і церебрального кровотоку. Протягом 2-х діб у «свіжих» ділянках невідновлення кровотоку визначалися порожні капіляри з некротизованим ендотелієм, оточені значно розширеними відростками астроцитів, в наступні 3–5-ть діб знекровлені порожні капіляри спадались і трансформувались в безклітинні тяжі базальних мембран. При стійкому невідновленні капілярного кровотоку в ранньому періоді активувався некроз поодиноких перикапілярних нейронів, а в подальші 3–5 діб виникали дрібні вогнища перикапілярного некрозу нейронів, дендритів, мієлінізованих аксонів і гліальних клітин. З перифокальних зон у вогнища перикапілярних мікронекрозів мігрували CD68-позитивні макрофаги та мікрогліоцити, які визначались при імпрегнації за Ріо-Гортеґа. На 5–7–9-ту добу ПРП у вогнища перикапілярних мікронекрозів з макрофагами мігрували фібрилоутворюючі астроцити, які визначались при імпрегнації за Кахалем. Вони спочатку формували навколо залишків базальних мембран зруйнованих капілярів дрібні вогнища замісного астроцитарного гліозу, а в наступному – вогнища гліофіброзу.

Через 2 тижні – 2 і більше місяців після КС в окремих нейронах головного мозку визначались явища так званої ретроградної дегенерації або ретроградних змін, які були обумовлені ішемічною деструкцією органел і мієлінової оболонки аксона зі спустошенням аксона, або руйнуванням мієлінізованого аксона у вогнищі перикапілярного некрозу. При мікроскопії гістологічних препаратів, забарвлених гематоксиліном і еозином або галоціаніном за Ейнарсоном, спустошені аксони спостерігались в нейропілі кори і в субкортикальній білій речовині великих півкуль головного мозку у хворих, померлих через 2 тижні – 2 місяці після КС, а деструктивні зміни мієлінових оболонок верифікувались в препаратах, забарвлених за Крутшау. Характерні для початку аксональної дегенерації явища центрального хроматолізу, що полягають у пилоподібному подрібненні і блідому забарвленні хроматофільної речовини в центральних відділах перикаріону нейрону, спостерігались вже на 5 добу після перенесеної КС в препаратах, забарвлених крезил-віолетом за Ніслем або гематоксиліном та еозином. Протягом 2-х тижнів центральний хроматоліз трансформувався в тотальний хроматоліз, при відсутності перинейронального сателітозу спустошений нейрон округлявся і збільшувався внаслідок набрякання, в його цитоплазмі часто накопичувалась значна кількість гранул ліпофусцину. Ретроградній загибелі нейрона передував лізис хроматину ядра, ексцентрично розташованого біля цитолеми, або глибокий каріопікноз. Максимально виражені ретроградні зміни нейронів визначались в гіпокампі і в корі великих півкуль мозку, в той час як в нейронах Пуркіньє кори мозочка ретроградні зміни не спостерігались.

Селективна загибель нейронів ЦНС шляхом апоптозу та некрозу проявлялась в ПРП арефлексією і коматозним станом хворих, вона не призводила до змін форми, розмірів і маси головного мозку, що реєструвалась при патологоанатомічному розтині померлих.

Встановлено, що незважаючи на імуногістохімічно верифіковану ініціацію апоптозу нейронів і мікроскопічно визначений селективний некроз нервових клітин, значна кількість ішемічно ушкоджених нейронів в ПРП відновлювалась при підтримці оточуючих гліальних клітин за умов ранньої активації адаптивно-метаболічної кооперації між гліоцитами і нейронами. За даними електронної мікроскопії у перші хвилини-години після перенесеної КС між ішемічно зміненими нейронами та перинейрональними олігодендроцитами і астроцитами виявлялася велика кількість активних контактів типу субповерхневих цистерн, щілинних і щільних з’єднань. Протягом першого тижня після КС відмічалась міграція гліальних клітин до ішемічно ушкоджених нейронів зі збереженим ядром і ядерцем, при світловій і електронній мікроскопії визначався феномен перинейронального астроцитарно-олігодендрогліального сателітозу. При ІГХ дослідженні в перинейрональних гліальних клітинах визначалася експресія антиапоптотичних молекул Bcl-X_L.

Проведені дослідження показали, що частково ушкоджені нейрони відновлювались в ПРП шляхом внутрішньоклітинної регенерації органел, що також відзначено в роботах Туманського В.О. (1987, 2002). За даними електронної мікроскопії протягом 3–6-ї доби в ішемічно ушкоджених нейронах, оточених гліальними клітинами-сателітами, активувався лізосомальний аутофагоцитоз зруйнованих цитоплазматичних компонентів. За даними ІГХ досліджень на 7-й добі після КС у експериментальних щурів в нейронах зареєстровано включення бромдезоксиурідину в цитоплазматичні структури, які за формою і локалізацією ідентифікувались при імерсійній мікроскопії як мітохондрії; в цей же термін ПРП при електронній мікроскопії в нейронах було відмічено збільшення числа дрібних мітохондрій з ущільненим матриксом і компактно запакованими кристами. Ці результати імуногістохімічно верифікували репаративний синтез мітохондріальної ДНК та електронно-мікроскопічно засвідчили збільшення кількості мітохондрій при відновленні структури ішемічно пошкоджених нейронів, а також підтвердили радіоавтографічні данні про включення попередників ДНК при новоутворенні мітохондрій (В.А. Туманский, 2002).

За даними електронної мікроскопії, через 9–12 діб після реанімації частково ушкоджені нейрони з ознаками структурного відновлення мали велике просвітлене ядро зі значною кількістю гранул рибонуклеопротеїдів і одним або двома великими ядерцями; в цитоплазмі помірної електронної щільності визначалась значна кількість невеликих мітохондрій з ущільненим матриксом і компактно запакованими кристами, полірибосом та ультраструктур зернистої і гладкої ЕПС, а також певна кількість невеликих вторинних лізосом і дрібних мієліноподібних залишкових тілець. Такі нейрони мали структурно нормальні аксо-соматичні і аксо-дендритні синапси. Через 12–30 діб в нейронах з великим ядерцем спостерігалось підвищене число дрібних мітохондрій, а також цистерн комплексу Гольджі і гранулярної ЕПС, що свідчило про інтенсивні біосинтетичні процеси; при світловій мікроскопії в помірно базофільній цитоплазмі визначались численні брилки хроматофільної речовини. Про раніше перенесені ушкодження свідчили дрібні осміофільні залишкові тіла або невеликі лізосоми з осміофільно-гранулярними включеннями.

Внутрішньоклітинна регенерація переважної більшості нейронів головного мозку забезпечувала відновлення сомато-неврологічного статусу експериментальних кішок на 5 добу ПРП, однак, повного структурного відновлення окремих нейронів ЦНС не спостерігалось навіть через місяць після реанімації експериментальних тварин.

ІГХ дослідження з використанням бромдезоксиурідину визначили особливості відновлення в ПРП популяцій гліальних клітин, які були раніше частково висвітлені при гісторадіоавтографії (Tumansky V., Tertyshny S., 1995; Туманский В.А., 2002). На 3–7 добі після КС визначено включення BrdU в ядра субвентрикулярних недиференційованих гліальних клітин, що свідчило про їх готовність до вступу у мітоз. Водночас з проліферацією недиференційованих субвентрикулярних гліоцитів відмічена міграція новоутворених гліальних клітин в ділянки ішемічних ушкоджень мозку, про що свідчила наявність біля ішемічно ушкоджених нейронів на 5 добі ПРП гліоцитів з залишками в ядрах BrdU, які за структурою ядер ідентифікувались як олігодендроцити і астроцити. Новоутворені астроцити і олігодендроцити разом з CD68+ макрофагами також формували в ПРП гліально-клітинні «вузлики» у великих півкулях і в стовбурі мозку.

ВИСНОВКИ

У дисертації приведено теоретичне узагальнення і нове рішення важливої для патологоанатомічної діагностики наукової задачі щодо морфогенезу селективної загибелі нейронів ЦНС, яка є основою коматозного стану хворих після реанімації, а також щодо структурного відновлення нервових клітин, ушкоджених після КС.

1. Головними морфогенетичними типами селективної загибелі нервових клітин в ПРП є патогенно-індукований апоптоз, каріоцитолізис і коагуляційний некроз, а також ретроградне руйнування нейронів, які розвиваються внаслідок постішемічно-реперфузійних і ексайтотоксичних ушкоджень, а також внаслідок стійкого невідновлення кровообігу в капілярах головного мозку. Апоптоз і селективний некроз нейронів мозочка, гіпокампа, стовбура та кори головного мозку найбільш виражений з 1-ї по 5–8-му добу ПРП, ретроградне руйнування кортикальних і стовбурних нейронів проявляється через 2 тижні – 2 і більше місяців після КС.

2. Початкові ішемічні ушкодження нейронів головного мозку проявляються через 60 хвилин – 24 години після КС з успішною реанімацією значним вакуолеподібним набряканням мітохондрій з руйнуванням крист, руйнуванням органел аксо-дендритних синапсів з редукцією синаптичних везикул, а також каріопікнозом і ішемічним ущільненням цитоплазми або набряканням каріоплазми і цитозолю нервових клітин.

3. За даними ІГХ та електронної мікроскопії, апоптоз нейронів у ПРП стимулюють внутрішні (Bax) мітохондріальні фактори і активовані внутрішньоклітинні домени мембранних Fas-APO-рецепторів, далі розвивається маргінація ущільненого хроматину і каріопікноз із збереженим великим ядерцем, ущільнення цитоплазми із збереженими мітохондріями і іншими органелами, каріорексис на гіперхромні «апоптотичні тільця», фрагментація нервових клітин і фагоцитоз відростками CD68+ макрофагів.

4. Порівняння даних ІГХ, світлової і електронної мікроскопії показує, що в ПРП значно розповсюджений каріоцитолізис і коагуляційний некроз нейронів головного мозку, в той час як апоптоз розвивається лише в частині нейронів, що експресують Bax і CD95/Fas. Вах-індукований апоптоз блокується при одночасній експресії нейроном антиапоптотичного білка Всl-X_L.

5. У процесі каріоцитолізису руйнуються мітохондрії, хроматин ядра і інші цитоплазматичні органели, що проявляється при світловій мікроскопії набряканням і спустошенням каріо-цитоплазми нейрона, який трансформується в «клітинну тінь». При коагуляційному некрозі спостерігається значне набрякання мітохондрій, коагуляція хроматину і руйнування ядерця, каріопікноз і ущільнення цитозолю, значне розширення цистерн ЕПС.

6. Ретроградне руйнування/дегенерація нейрона в ПРП починається з ішемічної деструкції органел і мієлінової оболонки аксона або із сегментарного руйнування аксона у вогнищі перикапілярного некрозу. Надалі, при відсутності перинейронального астроцитарно-олігодендрогліального сателітозу, наростає «хроматоліз» – невідновлення полірибосом і гранулярної ЕПС в цитоплазмі ушкодженого нейрона, що завершується ареактивним каріоцитолізисом нервової клітини.

7. При стійкому невідновленні кровотоку в церебральних капілярах виникає селективний некроз перикапілярних нейронів або дрібні вогнища перикапілярного некрозу нервової тканини з фагоцитозом зруйнованих структур CD68+ макрофагами і мікрогліоцитами.

8. Прогностичними ознаками відновлення ушкоджених нейронів є розвиток у перші 60 хвилин після КС перинейронального астроцитарно-олігодендрогліального сателітозу з експресією гліоцитами антиапоптотичних молекул Всl-X_L і збільшенням числа спеціалізованих гліо-нейронних контактів. При регенерації в ішемічно ушкоджених нейронах активується лізосомальний аутофагоцитоз зруйнованих ультраструктур цитоплазми, репарація ДНК мітохондрій із включенням у них бромдезоксиурідину, а також поступово зростає число мітохондрій, рибосом, ультраструктур зернистої та гладкої ЕПС.

9. У хворих, що померли в коматозному стані через 8–127 діб після КС, при нормальних макроскопічних параметрах головного мозку, у ділянках селективної загибелі нейронів мозочка, кори й стовбура головного мозку виявляються клітинні «випадіння» і дрібні вогнища астроцитарного гліозу, а також дрібні вогнища астроцитарного гліофіброзу в ділянках перикапілярного некрозу.