Експресія протеїнкінази D2 в нормальних та злоякісно трансформованих В-лімфоцитах ЛЮДИНИ : Экспрессия протеинкиназы D2 в нормальных и злокачественно трансформированных В-лимфоцитах ЧЕЛОВЕКА

summary

Матеріали та методи дослідження. Імуногістохімічні дослідження проводили на зрізах тканин реактивних лімфатичних вузлів (11 випадків) та мигдаликів (18 випадків), а також на біопсійному матеріалі пухлин пацієнтів з неходжкінськими злоякісними лімфомами В-клітинного походження (74 випадки) та класичною лімфомою Ходжкіна (43 випадки). Діагноз лімфом був встановлений у відповідності до класифікації ВООЗ на основі стандартних морфологічних, клінічних та імуногістохімічних критеріїв двома незалежними патогістологами і  верифікований к.б.н., с.н.с. Юрченко О.В. Усі пацієнти були попереджені про дослідження та дали свою поінформовану згоду на участь у їх проведенні.

В роботі було використано наступні лінії клітин людини: MP-1, LDN, CESS (В-лімфобластоїдні клітинні лінії, трансформовані вірусом Епштейна-Барр), RPMI-8226 (мієлома), REH, BLIN-1 та Nalm-6 (пре-В-клітинний лейкоз), BJAB, Ramos, Raji, Daudi (лімфома Беркітта), Jurkat, CCRF-HSB2 (гострий Т-лімфобласний лейкоз), KM-Н2 та L428 (лімфома Ходжкіна), Corinna II (хронічний лімфолейкоз), SUDHL5, SUDHL8, SUDHL9, OCILY3, OCILY10 та NUDHL1 (дифузні крупноклітинні В-клітинні лімфоми), НТВ119 (дрібноклітинний рак легені) та MCF-7 (рак молочної залози). В якості контролю для біохімічних досліджень було використано лізати клітин лінії НЕК293-Т, трансфікованих плазмідами pcDNA3.1-PKD1 та pcDNA3.1-PKD2. Лінії клітин культивували у поживному середовищі RPMI-1640 з додаванням 10% ембріональної сироватки телят, 2 мM L-глутаміна, 1 мМ пірувата натрію, амінокислотних добавок і антибіотиків. Для культивування клітинної ліній LDN до культурального середовища додатково вносили 50 мМ b-меркаптоетанолу. Клітинні лінії A431 (недрібноклітинний рак легені), HEK293-T культивували в середовищі DMEM з додаванням 10% ембріональної сироватки телят, 2 мM L-глутаміну, 1 мМ пірувата натрію, амінокислотних добавок, антибіотиків та, відповідно, 4 г/л  і 1 г/л глюкози.

Для імунофенотипування нормальних та злоякісно трансформованих клітин людини в роботі були використані моноклональні антитіла (МКАТ) проти CD3, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD38, CD45, CD95, CD150, IPO-38 (ІЕПОР), CD30 (Dako Cytomation, Данія).

          Експресію PKD1 та PKD2 на рівні білка визначали за допомогою специфічних кролячих поліклональних анти-PKD1/2 антитіл, що розпізнають як PKD1, так і PKD2, які були люб’язно надані проф. Ванлінтом (Католицький Університет, Льовен, Бельгія). Для ідентифікації PKD2 були використані специфічні кролячі поліклональні анти-PKD2 антитіла (Calbiochem, США). Рівень трансфосфорилювання і аутофосфорилювання PKD2 визначали за допомогою кролячих поліклональних антитіл анти-Ser706/710 PKD2 (Upstate, США) та анти-Ser876 PKD2 (Cell Signaling, США), відповідно. Експресію PKCbІІ виявляли з використанням кролячої анти-PKCbІІ (С-18) сироватки (Santa Cruz Biotechnology, США). В якості вторинних антитіл для Вестерн-блот аналізу були використані ослині анти-кролячі IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США), а при імунофлуоресцентному дослідженні – ослині антитіла проти імуноглобулінів кролика, мічені Alexa 488, та ослині антитіла проти імуноглобулінів кози, мічені Alexa 594 (Invitrogen, США). Для візуалізації продукта реакції в імуногістохімічних дослідженнях застосовували EnVision System (Dako Cytomation, США), або ослині анти-козячі IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США), DAB (Sigma-Aldrich, США) та АЕС (Sigma-Aldrich, США).

 Рівень експресії білків при імуногістохімічних дослідженнях оцінювали за допомогою балів (Н-score), які визначали формулою Н-score = 1ХСЛ + 2Х ПОМ + 3ХСИЛ, де СЛ – відсоток клітин із забарвленням слабкої інтенсивності; ПОМ –  відсоток клітин із забарвленням помірної інтенсивності, СИЛ – відсоток клітин із забарвленням сильної інтенсивності. В межах від 0 до 50 балів ступінь експресівважали за негативну; від 51 до 100 – низьку; від 101 до 200 – помірну; 201 та вище – високу (А. Упоров, 2000).

Для цитофлуориметричних досліджень при одномоментному фарбуванні клітин та подальшому їх сортуванні, а також внутрішньоклітинного виявлення рівня експресії PKD2 в субпопуляціях В-клітин мигдаликів були використані МКАТ анти-CD138-FITC та анти-CD27-APC (eBioscience, San Diego, США), анти-CD19-PE-Cy7 (Biolegend, San Diego, США), анти-CD38-PerCP-Cy5.5 та анти-IgD-біотин (BD Pharmingen, San Diego, США), стрептовідин-Alexa Fluor 700 (Invitrogene, Carlsbad, США) і ослині анти-кролячі IgG-RPE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, США).

Для стимуляції В- і Т-клітин застосовували лігацію антиген-розпізнаючих рецепторів козячими F(ab’)₂ проти IgM людини (Jackson ImmunoResearch, США), або анти-CD28 (BD Biosciences, США) та анти-CD3e (надані доктором С.Зіглер, Benaroya Research Institute, США), відповідно.

Для стимуляції клітин через В-клітинний рецептор (ВКР) були використані В-лімфоцити 14 пар мигдаликів та лінії клітин В-клітинного походження. Рівень експресії та фосфорилювання білків в клітинах вивчали за допомогою Вестерн-блот аналізу.

Для визначення субпопуляцій В-клітин використовували метод проточної цитофлуориметрії з одномоментним виявленням п’яти поверхневих маркерів. При визначенні внутрішньоклітинної експресії PKD2 в субпопуляціях В-клітин, після одномоментного виявлення 5 поверхневих антигенів проводили фіксацію та пермеабілізацію клітин з використанням набору Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, США). Сортування клітин виконували на проточному цитофлуориметрі/сортері FACSAria (BD Biosciences, США), а оцінку рівня інтенсивності флуоресценції – на проточному цитофлуориметрі LSR II (BD Biosciences, США) з використанням програми FACS Diva 6.0 (BD Biosciences, США). Отримані дані аналізували з використанням програм FACS Diva 6.0 (BD Biosciences, США) та FlowJo (Tree Star, Inc., США).

Для отримання препаративної кількості плазмід pcDNA3.1-PKD1 та pcDNA3.1-PKD2 був використаний штам E. coli TOP10 (Invitrogen, США). Плазмідну ДНК виділяли за допомогою набору реактивів Qiagen Plasmid Miniprep Kit (Sigma, США) згідно протоколу виробника.

            Для ідентифікації PKD1 та PKD2 на рівні мРНК було підібрано наступні праймери: для PKD1 прямий 5’GCGCTACAGTGTGGATAAGACCTTG-3’, зворотній 5’AGGAGTGTCACTGTGGCTAGCACTT-3’, для PKD2 прямий 5’-GCCAATGCCACCTACTTCGT-3’, зворотній 5’-GCTGGGTGCGTCCTGAA-3’. Контроль ЗТ-ПЛР проводили з використанням праймерів для гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази: прямий 5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’, зворотній 5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’.

Для секвенування, продукти ПЛР були виділені з агарозного гелю за допомогою набору реактивів для очищення Quigen gel isolation kit (Quigen, США). Для секвенування продукту, кДНК було клоновано у вектор pCAPs (Roche, США).

Секвенування проводили на капілярному секвенаторі Perkin-Elmer 310 в Університеті міста Ульм, Німеччина. Пошук в базі даних та порівняння послідовності ПЛР продукту та кДНК PKD2 (gi:4506968) проводили в опції nucleotide-nucleotide alignment (blastn) в Інтернет програмі BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ ).

Створення стабільних ліній клітин з надекспресією PKCbII здійснено за допомогою лентивірусної системи на основі вектора MSCV (Clontech, США).

Для вивчення впливу PKD2 на активність NF-kB проводили люциферазний тест оцінки активності NF-kB за допомогою набору Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System (Promega, Madison, США) згідно рекомендаціям виробника. В роботі були використані конструкції pcDNA3.1-PKD2-WT (PKD2 дикого типу), pcDNA3.1-PKD2-DA (PKD2 з постійно активованим кіназним доменом), pcDNA3.1-PKD2-KD (PKD2 в неактивованому стані), що були люб‘язно надані проф. T. Seufferlein (Німеччина) та pcDNA3.1-CARMA1-WT (CARMA1 дикого типу) проф. D.J. Rawlings (США). Суміш ДНК готували в середовищі без сироватки та за допомогою реагента Superfect (Qiagen, США) проводили трансфекцію плазмід IFN-Igk₂-Luc та TK-Renilla разом з конструкціями PKD2 та/або САRMA1 в pcDNA3.1. В якості контролю використовували порожній вектор pcDNA3.1. Через 40 годин після трансфекції проводили стимуляцію клітин антитілами до CD3 та CD28, половину кожного зразка відбирали для негативного контролю. Через 6 годин проводили лізис клітин в лізисному буфері фірми Promega (США). Рівень люмінесценції оцінювали за допомогою спектрофотометра Program Wallac Victor 3 tm 1420 multilabel counter (Perkin Elmer, США), використовуючи програмне забезпечення Wallac 1420 (Perkin Elmer Life Sciences, США). Кожен експеримент повторювали не менше трьох разів. Для всіх експериментів активність люциферази світлячка була нормалізована відносно люциферази Renilla. Для аналізу та інтерпретації даних використовували програму Excel (Microsoft, Redmond, США).

Результати досліджень та їх обговорення. Високий ступінь гомології PKD1 та PKD2 і відсутність специфічних антитіл для виявлення експресії цих кіназ сприяло початково створенню уявлень, що в В-лімфоцитах людини експресована PKD1. Однією з поставлених нами задач було з’ясування особливостей експресії PKD1 та PKD2 в клітинах лімфоїдного походження як на рівні білка, так і на рівні мРНК. Базуючись на різниці в молекулярній масі між PKD1 та PKD2, при використанні специфічних антитіл проти PKD2 у Вестерн-блот аналізі нами було з’ясовано, що в клітинних лініях лімфоїдного походження (досліджено 20 ліній клітин) та в зразках пухлин при різних формах неходжкінських злоякісних лімфом і при лімфомі Ходжкіна на рівні білка експресована PKD2, а не PKD1.