ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІЙ НИРОК У ЩУРІВ, ЩО ЗАЗНАЛИ СТРЕСУ ЗА ЗМІНЕНОГО ФОТОПЕРІОДУ

summary

Матеріал і методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на 288 старих (у віці 20-24 міс.) нелінійних самцях білих щу­рів масою 0,28-0,36 кг. Вивчали вплив гіпофункції шишкоподібної залози (ШЗ), а також одногодинного іммобілізаційного стресу (ІС) на тлі фізіо­логічної та зниженої функції ШЗ на хроно­рит­мічну організацію функцій нирок та їхні морфоло­гічні особливості, на морфо­функціональний стан епіфіза мозку, а також реактивну спроможність системи вільнорадикального окиснення ліпідів та білків (ВРОЛБ) крові.

Під час досліджень дотримувалися Директиви ЄЕС №609 (1986) та наказу МОЗ України №281 від 01.11.2000 р. «Про заходи щодо подальшого вдосконалення організаційних норм роботи з використанням експериментальних тварин». Досліди проведені згідно з вимогами комісії з біоетики БДМУ (протокол №3 від 16.02.2005).

Тварини з кожної серії досліду (І серія – тварини із фізіологічною функцією ШЗ, ІІ серія – тварини із гіпофункцією ШЗ) розподілені на чотири експериментальні групи: 1 група – інтактні щури, які виводилися з експерименту одночасно з дослідними тваринами для визначення контрольних показників; 2 група – щури, яким моделювали гострий ІС; 3-ю групу складали тварини, яким уводили епіталон впродовж трьох днів; 4-тій групі тварин уводили мелатонін за тією ж схемою. На 8-му добу експерименту досліджували хроноритми екскреторної, іонорегулювальної і кислотовидільної функцій нирок, функціональні зміни ШЗ, морфологічні особливості нирок та епіфіза мозку, а також показники анти-та прооксидантної системи крові.

Із метою з’ясування шляхів корекції стрес-індукованих морфофункціо­наль­них змін епіфіза мозку та нирок залежно від активності ШЗ, застосовано мела­тонін внутрішньочеревинно (Sigma, США) у дозі 2,5 мг/кг маси тіла (впродовж трьох останніх днів експерименту, останню ін’єкцію – за одну годину до ІС, який моделювали на 8-му добу). Для порівняння репаративної активності мела­тоніну до моделювання ІС використовува­ли також синтетичний пептид ШЗ – епіта­лон у дозі 0,5 мкг/кг маси щура, внутрішньом’язово (Санкт-Петербурзький інститут біоре­­гуляції та геронтології ПЗО РАМН, Росія). Препарати уводили щурам впродовж 3-х діб на 6, 7, 8-му доби експери­мен­ту. На 8-му до­бу експери­мен­ту, починаючи з 7-ої доби, у кожної гру­пи тварин збирали сечу з 4-годин­ним інтер­ва­лом для встановлення особливостей хроноритмічної орга­нізації основних ниркових функцій старих щурів, у кожній із серій експериментів проводили дослідження о 08.00, 12.00, 16.00, 20.00, 24.00 та 04.00 год.

Отримані індивідуальні хронограми для кожної тварини групували за принципом ідентичності максимальної акрофази і розраховували методом косинор-аналізу пересічні для кожної групи хронограм мезор, амплітуду і фазову структуру (за інтервалом часу між акро- та батифазою). Діагностика десинхронозу грунтувалася на основі аналізу змін характеристик мезору (середньодобового рівня), амплітуди, акрофази та форми кривої циркадіанного ритму.

Екскреторну функцію нирок оцінювали за величинами абсолютного та віднос­но­го діурезу, концентрації та екскреції іонів калію в сечі, концентрації креатиніну в се­­чі, швидкості клубочкової фільтрації, концентрації креатиніну в плазмі крові, від­нос­­ної реабсорбції води, концентраційного індексу ендогенного кре­ати­ніну, концен­тра­ції та екскреції білка в сечі (А. К. Меєрзон, 1968; В. М. Магаляс, А. И. Михеєв, 2001).

Іонорегулювальну функцію оцінювали за показниками екскреції іонів натрію та їх концентрації в сечі, абсолютної і відносної реабсорбції катіона, фільтраційного заря­­ду та кліренсу іонів натрію, натрій-калієвого коефіцієнта сечі, концентрації іонів нат­­­рію в плазмі крові, концентраційного індексу іонів натрію, величин проксималь­но­­го та дистального транспорту. Концентрацію іонів натрію та калію в сечі і плазмі кро­­­ві реєстрували методом фотометрії полум`я на фотометрі “ФПЛ-I” (Стеновая Е. А., 2001).

Кислотовидільну функцію нирок харак­теризували за концентра­цією актив­них іонів водню в сечі (рН сечі), екскрецією активних іонів водню, титрова­них кислот і амі­а­ку (Sauve R. et al., 2000). Визначення рН сечі здійснювали за допомогою мікробіоаналі­затора “Redelkys” (Угорщина), концентрацію кислот і аміаку в сечі – методом титрування (Шюк О., 1982).

Стандартизації показників функцій нирок досягали доведенням їх до оди­ниці на  100 г маси тіла тварини або об’єму клубочкового фільтрату на 100 мкл.

Для проведення гістологічних досліджень парафінові зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином (Venerucci F., 2001). Мікроденситометричним методом розподіляли клітини ШЗ на світлі та темні. При комп’ютерній мікроспектрометрії з використанням гістохімічної методики з бромфеноловим синім за методом Мікель-Кальво обраховували коефіцієнт Р (співвідношення кислих та основних білків) у клітинах нирок та ШЗ.

Ультраструктурні особливості будови клітин нирок та пінеалоцитів вивчали в електронному мікроскопі ЕМВ-100 ЛМ.

Вміст у плазмі крові мелатоніну визначали на запрограмованих апаратах «Wellwash 4 Mk 2», iEms Incubator/ Shaker «MULTISCAN ASCENT» виробництва «LABYSYSTEMS» (Фінляндія) із використанням тест-системи Direct Saliva MELATONIN ELISA фірми BUGELMANN (Швейцарія) у відповідності з рекомендаціями фірми. Концентрацію мелатоніну позначали у пг/мл.

В еритроцитах визначали вміст малонового альдегіду (МА), вивчали активність каталази (КТ), у плазмі крові досліджували вміст НS-груп, продуктів окисної модифікації білків (ОМБ) та церулоплазміну (ЦП) за стандартними методиками (Мещишен І.Ф., Григор’єва Н.П., Камышников В.С., 2003).

Статистичну обробку отриманих даних проводили на ПЕВМ “Pentium-4” за допомогою програм “Exсel-7”, “Statgraphics” (США) і “Косинор-аналіз”. Різницю в середніх тенденціях між групами дослідження, враховуючи нормальний розподіл даних (за критерієм Shapiro-Wilk), оцінювали за допомогою параметричного критерію Стьюдента. Враховуючи малий об’єм порівнюваних вибірок, для надійності висновків додатково застосували непараметричний критерій Mann-Whitney, який давав значення вірогідності близькі до критерію Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення.

Морфофункціональний стан нирок та епіфіза мозку на тлі  ІС. Одногодинне утримування щурів в іммобілізаційних клітках-пеналах віддзеркалилося: порушенням синусоїдального характеру ритму діурезу, дисбалансом механізмів гомеостазу іонів калію, зростанням відносної реабсорбції води, значною протеїнурією, натрійурезом, гальмуван­ням натрій-водневого антипорту, що спричинило зростання рН сечі в до­с­ліджувані інтервали доби. Крім того, слід звернути увагу на підвищення амп­літуд ритмів більшості досліджуваних показників, що свідчить про на­пру­ження компенсаторних механізмів, спрямованих на забезпечення гомеостазу. За таких умов експерименту біохімічно встановлено вірогідне зниження рівня мелатоніну до 17,5±1,0 пг/мл порівняно з інтактною групою щурів

При гістологічному дослідженні нирок у кірковій речовині відмічена зерниста дистрофія в епітелії звивистих канальців, яка охоплює 85,0±1,4 % клітин, на 80 % перевищуючи показник щодо такого в інтактних щурів. Виявлена загальна ішемізація кіркової речовини, особливо – капі­лярних петель клубочків. В епітелії проксимальних канальців рівень ОМБ підвищився на 44 %.

При гістологічному дослідженні епіфіза мозку стресованих тварин виявлено зменшення співвідношення між темними і світлими пінеалоцитами на 11 % щодо інтактної групи тварин. Коефіцієнт Р порівняно зі значеннями інтактних тварин зріс і становив у світлих пінеа­лоцитах 1,125±0,014, р<0,001 (в інтактної групи – 0,941±0,008), у тем­них пінеалоцитах, навпаки, зменшився до 1,240±0,016, р=0,029 (в інтак­тних – 1,189±0,012). Ультрамікроскопічно виявлено ознаки гіпофункції пінеалоцитів.

Вивчення процесів ВРОЛБ в крові за даних умов експерименту показало зростання по­каз­ників МА на 45,5 %, а рівень ОМБ підвищився удвічі стосовно даних інтактних тва­рин. Це свідчить про зростання окиснювальних процесів в організмі щурів, яких піддали ІС. Відмічається також зниження активнос­ті каталази та вмісту НS-груп внаслідок стресового впливу на 51,5 % та 42,6 % відповідно.

Вплив мелатоніну на стрес-індуковані зміни морфофункціонального стану нирок та епіфіза мозку старих щурів. На основі отриманих результатів корекції стрес-індукованих змін мела­то­ніном, виявлено нівелювання ефектів стресу щодо порушення швидкості клубочкової фільтрації та рівня азотемії, зниження мезора екскреції білка та концентрації його в сечі, натрійурезу, тенденцію до нормалізації структур хроноритмів рН сечі, екскреції кислот, що титруються, та аміаку.