| summary: | Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ, що сертифікована Державним фармакологічним центром (ДФЦ) МОЗ України (посвідчення № 07 від 29.09.2005р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ЛугДМУ (протокол № 1 від 19.01.2009 р.) а також методичних рекомендацій [Стефанов О. В., 2002].
Дослідження виконані на 510 білих нелінійних статевозрілих щурах обох статей масою 160-220 г. Тварини перебували в умовах віварію ЛугДМУ та одержували стандартну дієту у вигляді гранульованого корму за встановленими нормами.
Експериментально моделювали патологічний процес, що розвивався при одночасному впливі гіпоксичної гіпоксії та нагріваючого мікроклімату. Гіпоксію моделювали за допомогою спеціально розробленої камери співробітниками кафедри фармакології ЛугДМУ, в якій вміст кисню становив 10 об'ємних %, що досягалося шляхом витиснення кисню газоподібним азотом зі швидкістю 10 л/хв у першу хвилину, а потім протягом 12 хв зі швидкістю 0,5 л/хв. Контроль за вмістом кисню та вуглекислоти проводили з використанням мас-спектрометра «МХ-6203». Температура повітря в гермокамері становила 42 0С, яка підтримувалася автоматично за допомогою реле, вмонтованого у її стінки.
В скринінговій серії досліджень на моделі гострої гіпоксичної гіпоксії на фоні гіпертермії було використано 15 оригінальних похідних тіазолідину.
Як препарат порівняння був обраний пентоксифілін («Дарниця», Україна), висока протекторна активність якого ідентифікована раніше [Белоусова И. П., 2000]. Всі 15 сполук вводили одноразово внутришньоочеревинно (в/о) дозою 100 мг/кг у вигляді 1 % розчину за 40 хв до початку моделювання патології.
Ефективність сполук, що досліджувались, оцінювали за виживанням тварин [Лук'янчук В. Д. та співавт., 2002], а також за перебігом клінічної картини при досліджуваній формі гіпоксії.
У серії токсикометричних досліджень похідного тіазолідину Les-2140, як найбільш активної сполуки за результатами скринінгових досліджень визначали параметри гострої токсичності з використанням методу пробіт-аналізу [Прозоровський В. Б., 1962].
Екстраполяцію параметрів токсичності на людину, отриманих в експерименті, проводили методом [Рыболовьев Ю. Р., Рыболовьев Р. С., 1979] з використанням констант біологічної активності.
При розробці оптимального дозового режиму потенційного антигіпоксанту Les-2140 вводили в/о одноразово в різних дозах (100,0 та 200,0 мг/кг) і в різний час (за 30 хв та 60 хв до початку моделювання досліджуваного патологічного стану, а також безпосередньо перед посадкою тварин у камеру) у вигляді 1 % розчину. Математичний аналіз залежності середньої тривалості життя в умовах гіпоксії від введеної дози Les-2140 проводився методом двофакторного експерименту [Рафаэлес Е. Е. и соавт., 1971] за допомогою комп'ютерної програми [Кравец Д. С., 1999].
Всі дослідження виконані в динаміці: через 3, 6 й 24 год з моменту реоксигенації тварин. Біосубстратами для проведення комплексних біофізичних, біохімічних, а також фізико-хімічних досліджень у рамках поставлених у роботі завдань, були використані цільна кров, сироватка крові, кора головного мозку та печінка тварин.
Антирадикальну активність Les-2140 вивчали методом біохемілюмінісценції (БХЛ), яку реєстрували на люмінометрі "Emіllіte-1105" (спільного австро-німецького-російського виробництва) в сироватці крові та у гомогенаті кори головного мозку щурів. Кінетику БХЛ оцінювали за наступними показниками: амплітуді швидкого спалаху (I1), час індукції повільного спалаху (τ), амплітуді повільного спалаху (I2), амплітуді кінцевого значення БХЛ (IК), а також загальна світлосума реакції (S). Розрахунок досліджуваних параметрів робили за допомогою спеціально розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп'ютерної програми на базі процесора Іntel Pentіum.
Стан прооксидантно-антиоксидантної рівноваги організму оцінювали за вмістом у досліджуваних біосубстратах продуктів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) та активності основних компонентів (АОС) захисту організму в рамках алгоритму, передбаченого методичними рекомендаціями, розробленими співробітниками нашої кафедри [Лук’янчук В. Д. та співавт., 1999]. Так, стан АОС оцінювали за активністю двох ключових ферментів її ензимної ланки - СОД [Костюк В. А. та співавт., 1990] та каталази [Королюк М. А. та співавт., 1988], а також за рівнем відновленого глутатіону [Sedlusk J., Lindsey H., 1969] та вільних SH-груп [Ellman G. L., 1959] Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами оцінювали за станом перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) [Архипова О. Г., 1988].
При комплексному вивченні фармакодинаміки Les-2140 визначали стан енергетичного обміну за рівнем АТФ, АДФ та АМФ в еритроцитах за допомогою методу тонкошарової хроматографії (ТСХ) на пластинах фірми «Merk» (Німеччина) [Захарова Н. Б., Рубін В. И., 1980]. На підставі отриманих при цьому даних розраховували показники, що характеризують стан енергетичного гомеостазу: енергетичний заряд (ЕЗ) за формулою ЕЗ=(АТФ+1/2АДФ)/(АТФ+АДФ+АМФ), енергетичний потенціал (ЕП) за співвідношенням ЕП=АТФ/АДФ, порівняльний коефіцієнт (Кпор) за формулою Кпор=(АТФ+АМФ)/АДФ, індекс фосфорилювання (ІФ) за співвідношенням ІФ=АТФ/(АДФ+АМФ), а також термодинамічний контроль дихання (ТКД) за формулою ТКД=АДФ/АМФ [Лук’янчук В. Д., Савченкова Л. В., 2000].
Вплив Les-2140 на стан вуглеводного обміну у тварин з гіпоксичним синдромом оцінювали за рівнем основних постачальників енергії в клітинах – глюкози (набори фірми «Філісіт-діагностика») і глікогену [Покровський О. О., 1964], а також проміжного продукту метаболізму глюкози – піровиноградної кислоти і кінцевого продукту її анаеробного перетворення – молочної кислоти у крові та корі головного мозку тварин.
Для збільшення коректності оцінки стану вуглеводного обміну розраховували окислювально-відновний потенціал (ОВП) системи молочна-піровиноградна кислоти [Райскіна М. Е. та співавт., 1974].
Важливим етапом доклінічного вивчення будь-яких потенційних ліків є фармакокінетика, центральною ланкою якої становить біотранспорт. Для вивчення процесів зворотнього комлексоутворення компонентів крові як тест-ліганд використовували динітроортокрезол (ДНОК). Концентрацію ДНОК в діалізаті визначали за методом [Кравець Д. С., 2001]. Зв’язуючу здатність білків цільної сироватки крові, мембран еритроцитів та 4 % водного розчину альбуміну з ДНОК вивчали методом рівноважного діалізу [Луйк А. И., Лук’янчук В. Д., 1984]. Для доведення зворотних процесів комплексоутворень ДНОК з досліджуваними біосубстратами використали відповідність отриманих в експерименті значень вільних фракцій ДНОК у великих дослідних та контрольних камер діалізного апарату закону діючих мас, тобто можливості їх лінеаризації в координатах Скетчарда, як це зазначено в [Луйк А. И., Лук’янчук В. Д., 1984].
Кількісні параметри зворотнього комплексоутворення - константу асоціації (Кас) комплекса «білок-ліганд» і число місць зв'язування (N) визначали відповідно до методичних рекомендацій ГФЦ МОЗ України [Київ, 2002] в динаміці. Розрахунок величин Кас та N проводили за допомогою спеціальної комп'ютерної програми, розробленої в середовищі Turbo Pascal v.7.0 [Кравець Д. С. 2000].
Стан мітохондріальних та мікросомальних ланцюгів транспорту електронів у гепатоцитах в умовах експерименту оцінювали за допомогою ЕПР-спектрометрії через 3, 6 й 24 год з моменту реоксигенації за положенням та величиною амплітуди наступних парамагнітних центрів гепатоцитів з g-факторами: 1,94 – залізосірчані білки (ЖСБ); 1,97 - Мо5+–вмісні комплекси; 2,00 – вільні радикали; 2,03 – нітрозильні комплекси заліза (НКЖ); 2,17 - Мn2+–вмісні парамагнітні центри; 2,25 – цитохром Р-450 низькоспиновий, 2,45 – цитохром Р-450 окислений [Ажипа Я. И., 1983].
Всі використані в роботі одиниці виміру та параметри наведені відповідно до міжнародної стандартної системи одиниць [Липперт Г., 1980]. Отримані дані оброблялись статистично загальноприйнятими методами з використанням програми Statgraf, оцінюючи вірогідність на рівні значення не менш 95 % (Р<0,05) з використанням критерію Ст’юдента, а також непараметричного критерію статистики - точного методу Фішера для чотирипільної таблиці [Гублер Е. В., 1978].
|
