МЕХАНІЗМИ ЦИТОТОКСИЧНОЇ ДІЇ ЛАНДОМІЦИНУ Е НА ПУХЛИННІ КЛІТИНИ IN VITRO : МЕХАНИЗМЫ цитотоксического действия Ландомицинив Е НА опухолевых клеток IN VITRO

summary

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовували ЛЕ, який було отримано у лабораторії проф. Мацелюха Б.П. (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, Україна) (Поліщук Л.В. та ін., 1996; Мацелюх Б.П. та ін., 1998). Структуру ЛЕ було з’ясовано проф. J. Rohr (Rohr J. et al., 1997). Активність ЛЕ на злоякісно трансформовані клітини порівнювали з дією протипухлинних препаратів адріаміцину, мітоксантрону, метотрексату, цисплатину (Ebeve, Австрія), вінкристину (Richter, Угорщина), флуороурацилу (Дарниця, Україна), дауноміцину, блеоміцину (Sigma, США). Використовували інгібітори ABC-транспортерів верапаміл (Abbott, Австрія), іматиніб (Novartis, Швейцарія), гефітиніб (Teva, Ізраїль).

У роботі було використано 27 клітинних ліній (25 з яких лінії пухлинних клітин і 2 – нормальних), представлених широким спектром тканинного поход-ження, як вихідних, так і резистентних до хіміопрепаратів.

Клітини вирощували згідно з рекомендаціями АТСС (American Type Culture Collection) у культуральному середовищі DMEM або RPMI 1640 (Sigma, США) за присутності 10% декомплементованої (56⁰C, 30 хв) сироватки крові ембріонів корів (РАА, Австрія) і 50 мкг/мл гентаміцину (Sigma, США) в СО₂-інкубаторі з 5% вмістом СО₂ при 37⁰С і 95% вологості. Клітини пересівали через кожні дві-три доби розведенням клітинної суспензії у співвідношенні 1:5. У дослідах використовували клітини, серед яких кількість мертвих не перевищувала 3%.

Антипроліферативну дію препаратів оцінювали кількісно за величиною ІС₅₀, яка дорівнювала концентрації препарату, що необхідна для зменшення загальної кількості живих клітин на 50% порівняно з контролем.

Підрахунок кількості живих і мертвих клітин при фарбуванні трипановим синім здійснювали в гемоцитометричній камері.

Дослідження впливу різних препаратів на життєдіяльність клітин визначали МТТ-тестом із використанням барвника тетразолію, принцип дії якого базується на здатності дегідрогеназ мітохондрій живих клітин відновлювати тетразолій жовтого кольору до формазану пурпурового кольору. Через 72 год інкубації клітин із препаратом визначали кількість живих клітин згідно з рекомендаціями виробника набору EZ4U (Biomedica, Австрія).

Морфологію досліджували прижиттєвим фарбуванням клітин акридином оранжевим і фарбуванням фіксованих препаратів азур-еозином за Романовським-Гімза. Для флуоресцентного контрастування структури ядер клітин КВ-3-1 використовували барвник DAPI (Sigma, США) в концентрації 1 мкг/мл.

Для дослідження здатності ЛЕ до інтеркаляції в ДНК сперми лосося (Sigma, США) використовували метод термоденатурації ДНК (Krey A.H. et al., 1969) та метод конкурентного витіснення метилового зеленого з його комплексу з ДНК (Schmeller T. et al., 1997). Здатність ЛЕ зв’язуватися з ДНК оцінювали за допомогою методу тонкошарової хроматографії на силуфольних пластинках (Avalier, Чехія) за зниженням хроматографічної рухливості, що свідчить про зростання спорідненості речовини до ДНК (Maier A. et al., 1999), а також за впливом ЛЕ на електрофоретичну рухливість продуктів розщеплення ДНК фага λ (NEB, США) рестриктазою Pst 1 (Sigma, США) на фрагменти розміром ~200–11500 пар нуклеотидів.

Вплив ЛЕ на синтез ДНК в клітинах лінії KB-3-1 вивчали за інтенсивністю включення ³Н-тимідину (Amersham Biosciences, США). Отримання клітинних лізатів і вимірювання радіоактивності на проточному сцинтиляційному лічильнику Tri-Carb 1900TR (Packard, США) здійснювали згідно з рекомендаціями (Heffeter P. et al., 2006).

Дослідження клітинного циклу після фарбування пропідію йодидом здійснювали на проточному цитометрі FACS Calibur (Becton Dickinson, Palo Alto, США).

Міжнуклеосомну фрагментацію ДНК апоптотичних клітин досліджували за допомогою електрофорезу в гелі 1,5% агарози (Singh N. et al., 1988; Кудрявец Ю.И. та ін., 1996). Зони ДНК виявляли в ультрафіолетовому світлі та фотографували через оранжевий світлофільтр цифровою камерою Olympus C4000 (Японія).

Для детекції внутрішньоклітинної продукції вільних радикалів використовували 2,7-дихлорфлуоресцеїн диацетат (DCF-DA) (Elbling L. et al., 2005).

Для інгібування утворення активних метаболітів кисню використовували поглинач радикалів N-ацетил-цистеїн (Sigma, США) в кількості 1 або 2 ммоль/л.

Внутрішньоклітинний вміст АТФ визначали з використанням люциферази, оцінюючи рівень біолюмінесценції, що властива метаболічно активним клітинам, за допомогою наборів реагентів ViaLight MDA Plus Cytotoxicity та Cell Proliferation BioAssay Kit (Cambrex, Verires, Бельгія ) згідно з рекомендаціями виробника.

Функціонування мітохондрій під впливом ЛЕ оцінювали за їх здатністю накопичувати флуоресцентний барвник родамін-123 (Heffeter P. et al., 2005), а також із використанням барвника JC-1, що входить до набору Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit (Stratagene, США). У живих клітинах JC-1 акумулюється в мітохондріальному матриксі й зафарбовує його в яскраво-червоний колір, а в апоптотичних клітинах, де має місце втрата мембранного потенціалу, він залишається в цитоплазмі в мономерній формі, обумовлюючи зелене забарвлення.

Вестерн-блот аналіз лізатів клітин використовували для виявлення прокаспаз-3 і -7 та розщепленої форми каспаз-3 і -7, а також репараційного ензиму PARP-1 і його розщепленої форми за допомогою відповідних антитіл (Cell Signaling, США). Для нормалізації кількості нанесення білка використовували антитіла AC-15 до ß-актину (Sigma, США).

Cтатистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програм GraphPad Prizm 5 (Каліфорнія, США) та Origin 7 (Microcal, США). Варіаційно-статистичне опрацювання отриманих результатів здійснювали з використанням
t - критерію Ст’юдента за допомогою комп’ютерної програми Microsoft Excel 2007.