РІВЕНЬ ГІПОКСІЇ У ЗЛОЯКІСНИХ ПУХЛИНАХ ТА ОЦІНКА ЙОГО ПРОГНОСТИЧНОГО ЗНАЧЕННЯ (експериментально-клінічне дослідження) : УРОВЕНЬ гипоксии В злокачественной опухоли И ОЦЕНКА ЕГО прогностическое значение (экспериментальное исследование)

summary

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 195 мишах лінії С₅₇Bl/6 (самки, маса 22-25 г) розведення віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України з перещепленою карциномою 3LL (внутрішньом’язово, 0,5x10⁶ клітин на тварину). Усі досліди на тваринах здійснювались згідно вимогам регіонального Комітету з етики роботи з піддослідними тваринами та з додержанням  правил роботи з лабораторними тваринами.

Розмір пухлини вимірювали 5 разів на тиждень. Об'єм пухлини визначали за загальноприйнятою формулою об'єму еліпсоїду.

Тварини були розподілені на 7 експериментальних груп в залежності від доби після перещеплення, коли пухлини були використані у дослідженні: 1 група - 12 доба (об’єм пухлини 0,4 ± 0,1 см³); 2 - 14 доба (0,8 ± 0,2 см³) ; 3 - 16 доба (0,9 ± 0,2 см³); 4 - 18 доба (1,1 ± 0,3 см³); 5 - 21 доба (1,4 ± 0,3 см³); 6 - 24 доба (1,9 ± 0,5 см³) та 7 - 27 доба (2,3 ± 0,4 см³).

Для ЯМР спектроскопії зразок тканини, що досліджувалась, складав 2,9 г. При невеликих розмірах пухлин для отримання одного тканинного зразка для ³¹Р ЯМР спектроскопії, пухлини одного і того ж об’єму поєднували разом. Для кожної часової точки було отримано від 5 до 7 зразків. Одночасно для кожної експериментальної групи були отримані зразки м’язової тканини.

Хворі, операційний матеріал яких було використано для досліджень, передопераційної терапії не отримували. Матеріал був наданий відділеннями абдомінальної онкології та гінекології Інституту онкології АМН України (нині Національний інститут раку МОЗ України) у період із 2002 по 2006 р. та Міською онкологічною лікарнею м. Києва МОЗ України у період із 2004 по 2007 р. Всі хворі були проінформовані про обстеження та дали згоду на використання хірургічного матеріалу в дослідницьких цілях. Стадія пухлинного процесу (РШ і РШМ) визначалася у відповідності до класифікації пухлин за системою TNM (6 видання, 2002) та FIGO (2006) для РШМ.

Зразки пухлинної тканини були отримані від хворих на РШ (n=118), з них 70 чоловіків і 48 жінок. Середній вік хворих становив 57 ± 0,9 року (віковий діапазон від 31 до 80 років). 13 (11%) пацієнтів становили хворі з І, 27 (23%) – з ІІ, 46 (39%) – з ІІІ, 32 (27%) – з ІV стадією пухлинного процесу.

Крім того, в роботі були дослідженні зразки пухлинної тканини, отримані від хворих на РШМ (n=34). Середній вік хворих становив 43,5 ± 2,9 року (віковий діапазон від 27 до 70 років). Більшість пацієнтів – 16 (47%) склали хворі з І, 9 (26,5%) – з ІІ, 9 (26,5%) –  з ІІІ стадією пухлинного процесу.

³¹Р ЯМР спектроскопія проводилась у ПХЕ тканин карциноми 3LL, ³¹Р та ¹Н ЯМР спектроскопія – в ПХЕ операційного матеріалу (тканина РШ, “нормальна” слизова тканина шлунка, тканина РШМ).

³¹Р ЯМР спектри ПХЕ карциноми 3LL реєстрували на спектрометрі Mercury-300BB (Varian, США), ³¹Р та ¹Н ЯМР спектри операційного матеріалу – на спектрометрі Bruker 400 MГц (Widebore Ultrashield, AV-400 electronics, Німеччина). Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma) була за внутрішній стандарт (³¹Р ЯМР спектри). Всі ³¹Р хімічні зрушення у спектрах були співвіднесені до сигналу РСr, який був позначений як 0.0 ppm (part per million – міліонна частина). Натрієва сіль 3-(триметилсіліл)пропіонової кислоти слугувала за внутрішній стандарт (0.0 ppm) – для ¹Н ЯМР спектрів. Області сигналів на спектрах вимірювались інтегральним способом, що обчислював прибор.

Для оцінки змін рівня гіпоксії в тканинах використовували співвідношення: Pi/PCr, Pi/βNTP, PME/βNTP та PME/Pi, визначені ³¹Р ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини. ³¹Р ЯМР спектри м'язової тканини – спектри нормальної тканини тварин-пухлиноносіїв і одночасно є контролем процедури перхлорної екстракції зразків пухлинної тканини. Для оцінки рівня лактату в тканині РШ використовували співвідношення Lac/Cr, визначене ¹Н ЯМР спектроскопією ПХЕ тканини. Вміст лактату в пухлинах визначали загальновживаним біохімічним методом з використанням лактатдегідрогенази.

Виявлення експресії білку СА-9 на парафінових зрізах тканин РШ та РШМ проводили за допомогою ІГХ методу. В якості первинних антитіл використовували поліклональні кролячі антитіла проти СА-9 (ab15086, “Biozol”, Німеччина). Для візуалізації продукту реакції в ІГХ дослідженнях застосовували EnVision та DAB (Dako Cytomation, Данія).

Результати фарбування оцінювали за A. Mayer та співавт. (2005), а саме: категорія 0 - відсутність фарбування або декілька позитивних клітин ("експресія негативна"); категорія 1 - <10 % позитивних клітин ("низька експресія"); категорія 2 - від 11 % до 50 % позитивних клітин ("помірна експресія"); категорія 3 - > 50 % позитивних клітин ("висока експресія").

Проводилася відповідна статистична обробка отриманих результатів: різницю між показниками оцінювали використовуючи t-критерій Стьюдента. Кореляційний аналіз проводили з використанням коефіцієнтів кореляції Пірсона (r) та Спірмана (r_s). Прогностичне значення показників оцінювали за допомогою пропорційної моделі Cox з використанням χ² тесту та коефіцієнту ризику (Нazard ratio (HR)). Виживаність хворих визначали за методом Kaplan-Meier, розбіжності між кривими виживаності аналізували за допомогою log-rank тесту. Статистична значимість прийнята при р<0,05. Для аналізу та інтерпретації даних використовували пакет прикладних програм NCSS 2000/PASS 2000 та Prism, version 4.0.