МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ГІПЕРСКОРОТЛИВОСТІ СУДИН, ІНДУКОВАНОЇ ІОНІЗУЮЧИМ ОПРОМІНЕННЯМ, ТА ЇЇ ФАРМАКОЛОГІЧНА КОРЕКЦІЯ : Молекулярные механизмы ГИПЕРСКОРОТЛИВОСТИ СОСУДОВ, индуцированные ионизирующего облучения, И ЕЕ фармакологической коррекции

summary

Матеріали та методи досліджень. Експериментальна робота була виконана на 125 статевозрілих білих щурах лінії Wistar, масою 220-280 г, які утримувалися на стандартному раціоні годування віварію ДУ «Інститут фармакології та токсикології АМН України», при природній зміні дня та ночі. Всі експериментальні процедури проводили у відповідності з «Положенням про використання тварин у біомедичних дослідженнях» [Стефанов О.В., 2002.].

Методика реєстрації інтегральних трансмембранних струмів ізольованих гладеньких м’язових клітин грудної аорти щурів. ГМK виділяли з грудної аорти щура шляхом ферментативно-механічної ізоляції за допомогою колагенази (тип ІА, 2 мг/мл), пронази Е (0,5 мг/мл) та сироваткового альбуміну бика (2 мг/мл) в модифікованому розчині Кребса.

Для реєстрації інтегрального трансмембранного струму цілої клітини використовували метод фіксації мембранного потенціалу (patch-clamp) в конфігурації “ціла клітина” із застосуванням антибіотика амфотeрицину Б. Реєстрацію струмів проводили за допомогою підсилювача Axopatch 200B Patch-Clamp та програмного забезпечення pClamp Software (версія 6.02, «Axon Instruments Inc.», США). Типові значення мембранного опору клітин в експериментах складали 2-5 ГОм. Реєстрацію іонних струмів здійснювали шляхом ступінчастих деполяризуючих зміщень мембранного потенціалу на 10 мВ, тривалістю 300 мс, від підтримуваного -60 мВ. Отримані макроскопічні сумарні струми нормували на величину ємності мембрани, яка пропорційна площі клітинної мембрани та виражена в пА/пФ. Скляні мікропіпетки для реєстрації іонних струмів виготовляли з боросилікатного скла («Clark Electromedical Instruments», Великобританія) за допомогою пристроїв для витягування мікроелектродних піпеток Model P-97 («Sutter Instrument Corporation», США) та для полірування кінчиків мікроелектродів Micro Forge MF-900 («Narishige», Японія). Отримані мікропіпетки мали опір 2,5-5 МОм.

Методика виділення РНК з судинної стінки грудної аорти щурів та проведення полімеразної ланцюгової реакції з використанням зворотної транскрипції. Виділення тотальної РНК із гладеньких м’язових клітин аорти щура проводили із використанням набору Trizol RNA-prep («Isogen», Росія). Зворотну транскрипцію тотальної РНК (300-400 нг) проводили із використанням Random hexamer праймеру та зворотної  транскриптази RevertAid™ H Minus («Fermentas», Литва). Напівкількісну полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в об’ємі 25 мкл реакційної суміші, яка містила 5 мкл 5×ПЛР буферу з MgCl₂, 0,2 ммоль dNTPmix, 10 Од Taq полімерази («AmpliSense», Росія) та по 40 пмоль специфічних праймерів для генів ВК_Са α- та β1-субодиниць ВК_Са. Ампліфікація фрагментів ВК_Са каналів включала 43 цикли, кожен з яких складався з денатурації ДНК при 94°С (45 с), гібридизації праймерів при 62,5°С (45 с) та елонгаціїї при 72°С (45 с) в термоциклері (GeneAmp System 2700, «Applied Biosystem», США). Для контролю якості ізольованої РНК та порівняння інтенсивності експресії генів ВК_Са каналів було використано в якості зовнішнього контролю фрагмент гену β-актину – одного із house-keeping генів. Продукти ПЛР детектували в 1,6% агарозному гелі, що містив етидіум бромід. Детекцію ампліфікованих фрагментів після горизонтального електрофорезу (160 V, 30 хв) проводили у трансілюмінаторі з програмним забезпеченням Vitran («Biocom», Росія).

Ампліфікацію фрагментів К⁺ каналів з використанням ПЛР-реакції в реальному часі проводили за допомогою термоциклера «7500 Fast Real-Time PCR System» («Applied Biosystem», США) у 10 мкл реагенту «SYBR Green PCR Master Mix», що містив 30 пмоль кожного праймеру. Програма ампліфікації починалася з попередньої активації AmpliTaq Gold® ДНК-полімерази протягом 10 хв при 95 та складалася з 45 циклів: денатурації при 95 °C (15 с), гібридизації та елонгації праймерів при 60 °С (60 с). Аналіз отриманих даних проводився за допомогою програмного забезпечення 7500 Fast Real-time PCR Software («Applied Biosystem», США).

Методика блокування експресії гену ВК_Са каналів KCNMA1 за допомогою siРНК. Малі інтерферуючі РНК (siРНК) для заглушення гену KCNMA1, який кодує ВК_Са α-субодиницю, а також індиференті (scrambled) РНК (scrРНК), що не впливають на експресію жодного гена, були синтезовані фірмою «Metabion» (Німеччина) і мали наступну послідовність нуклеотидів: KCNMA1-Sense 5′-gucugccaacagggagagguu-3′, KCNMA1-Antisense 5′-gcucucccu guuggcagacuu-3′, Scr-Sense 5′- uguucagcgaaauauaaccuu-3′, Scr-Antisense 5′-gguuauauuucgcugaacauu-3′. Двократне введення специфічних до мРНК               α-субодиниці BK_Ca каналів дволанцюгових siРНК чи scrРНК (отриманих після аннелінгу за протоколом виробника) здійснювали у хвостову вену щурів в кількості 80 мкг/кг з 24-годинним інтервалом.

Методика опромінення тварин. Піддослідні щурі підлягали загальному одноразовому зовнішньому γ-опроміненню з використанням джерела ⁶⁰Со «ТГТ Рокус-М» (Росія). Потужність при опроміненні складала 0,833 Гр/хв, доза – 6 Гр. Дослідження проводили на 9-11 та 30-32 добу після опромінення.

Методика реєстрації скорочувальної активності гладеньком’язових судинних препаратів. В дослідах тензометрично реєстрували зміни тонусу ізольованих судинних препаратів в режимі, що наближався до ізометричного за допомогою ємнісних датчиків напруження. Виділену аорту звільняли від сполучної тканини та нарізали на кільцеві сегменти шириною 0,5-1,0 мм. Для досліджень констрикторної спроможності здійснювали попередню деендотелізацію судинних препаратів шляхом їх 15-хвилинної інкубації у розчині із сапоніном (0,1 мг/мл). Сегменти аорти щурів поміщали у робочу камеру між стаціонарним гачком і штоком датчика напруження та витримували 45-60 хв в ізометричному режимі з навантаженням (10-20 мН), перфузуючи стандартним буферним розчином Кребса з постійною швидкістю (2,5-3,0 мл/хв). Реєстрацію скорочень м’язових сегментів судин здійснювали за допомогою аналогово-цифрового перетворювача Lab-Trax 4/16 («World Precision Instruments», США), з’єднаного з персональним комп’ютером. Констрикторну спроможність сегментів аорти щурів вивчали при введенні в перфузуючий розчин артеренолу (10^-9-10^-5 моль/л). Ендотелій-залежне розслаблення судин контролювали після поєднаного додавання до зовнішнього розчину артеренолу (10^-6 моль) та ацетилхоліну (10^-9-10^-5 моль/л).

Методика реєстрації артеріального тиску у щурів. Виміри артеріального тиску проводили неінвазивним шляхом в хвостовій артерії щурів до опромінення та на 30-ту добу після опромінення. Для цього був використаний вимірювальний комплекс SPHYGMOMANOMETER S-2 («HSE», Німеччина).

Реактиви та розчини. В дослідженнях використовували паксилін, тетраетиламоній, сироватковий альбумін бика, NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂·2H₂O, HEPES, D-глюкоза, артеренол та ацетилхолін виробництва компанії «Sigma» (США), кверцетин виробництва «Merck» (Німеччина). Ліпосомальний кверцетин (Ліпофлавон) та фосфатидилхолінові ліпосоми (Ліпін) (виробництва ЗАТ «Біолік», Україна) розводили бідистильованою водою для отримання маточного розчину. Маточний розчин кверцетину отримували розведенням етиловим спиртом (96%). Для створення потрібної концентрації досліджуваних речовин в робочий розчин (розчин Кребса) вносили необхідну кількість маточних розчинів.

Методи математичного аналізу. Статистичну обробку даних виконували за допомогою програми Origin 7.5 (OriginLab Corporation, США) та Microsoft Exel. Результати представлені у вигляді середнього арифметичного (М) та стандартної похибки середнього арифметичного (m) для певної вибірки (n). Порівняння отриманих величин проводилось з використанням параметричного t-критерію Стюдента, методом кореляційного та однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) [Гланц С., 1999]. Зміни вважали статистично достовірними при Р<0,05. Величини ЕС₅₀ для залежностей доза-ефект отримували з апроксимацій експериментальних даних кривої Хілла.