КЛІНІКО-ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ОРОЗОМУКОЇДУ ПРИ ЖОВТЯНИЧНИХ ФОРМАХ ВІРУСНИХ ГЕПАТИТІВ

summary

Матеріали та методи досліджень. Для вирішення поставлених у дисертації задач проведено клініко-лабораторне обстеження 181 хворого з жовтяницями вірусного та пухлинного ґенезу віком від 15 до 75 років, серед яких: хворих на жовтяничні форми гострих вірусних гепатитів (ГВГ) – 108, з них 49 – ВГ А , 42 – ВГ В та 17 – ВГ С; хворих на хронічні вірусні гепатити (ХВГ) – 32, цироз печінки – 9, хворих з пухлинами ПДЗ, ускладнених обтураційною жовтяницею – 32. Для контролю показників обстежено 35 здорових людей у віці від 18 до 65 років.

Серед хворих на  ГВГ було 54 чоловіка (50%) та 54 жінки (50%). Переважна кількість хворих даної групи, залучених до дослідження були віком до 40 років (76,9%).

В усіх хворих на ГВГ В діагноз був підтверджений наявністю в сироватці крові серологічних маркерів ГВГ В (HВsAg, анти -HВcAg IgM), при відсутності анти - HАV IgM та анти - HСV IgM ; у хворих на ВГ А – наявністю анти- HАV IgM при відсутності маркерів ВГ В та ВГ С, у хворих на ГВГ С – наявністю анти- HСV IgM та RNA HCV.

Важкість ГВГ визначали з урахуванням самопочуття, ступеня інтоксикації, інтенсивності жовтяниці, наявності геморагічного синдрому, показників біохімічного дослідження крові. Обстежено 27 хворих на легку форму ГВГ, 54 – на гепатит середньої важкості, 24 – на важкий, 3 – на фульмінантний гепатит.

При легкому перебігу ВГ, незалежно від етіології, прояви інтоксикації були слабкими, у розпал хвороби спостерігалась незначна жовтяниця шкіри та слизових. Тривалість жовтяничного періоду коливалась від 3–4 діб при ВГ А і до 3–4 тижнів при ВГ В. Хворі на легкий гепатит у періоді розпалу захворювання отримували базисну терапію (дієта, оральна детоксикація, симптоматичні засоби) та гепатопротектори на початку реконвалесценції.

При ВГ середньої важкості у переджовтяничному та жовтяничному періодах були помірно виражені симптоми інтоксикації у вигляді слабкості, швидкої втомлюваності, анорексії, нудоти, інколи блювання, болі у правому підребер’ї та епігастрії. У розпал хвороби відзначалася помірна жовтяниця. Хворим на ВГ середньої важкості проводилась оральна та парентеральна детоксикаційна терапія, призначались симптоматичні препарати, на початку реконвалесценції–гепатопротектори.

У хворих на важкі форми ВГ в клінічній картині переважала виражена інтоксикація, що проявлялась такими симптомами, як різка слабкість, адинамія, головний біль, порушення сну, анорексія, постійна нудота, блювання, біль у животі. При обстеженні у розпалі захворювання відзначалася виражена жовтяниця. Тривалість жовтяничного періоду становила понад чотири тижні. Хворим на важкі ВГ проводилась інтенсивна парентеральна та оральна детоксикаційна терапія, призначались симптоматичні засоби, гепатопротектори, глюкокортикостероїдні препарати.

Серед обстежених було 3 хворих на фульмінантний ВГ В у віці від 20 до 26 років. Всі вони потрапляли до лікарні у дуже важкому стані (біль у правому підребер’ї, нудота, блювання, геморагії, тахікардія, виражена жовтяниця, симптом «порожнього» підребер’я, неврологічна симптоматика). Незважаючи на інтенсивну терапію, яка включала введення препаратів лактулози, парентеральне введення глюкозо-сольових розчинів, глюкокортикоїдів, інгібіторів протеолізу, препаратів крові, плазмаферез стан хворих погіршувався. Всі хворі померли при явищах гострої печінкової недостатності.

На окремі групи були  розподілені хворі на ВГ А і В з наявністю синдрому холестазу та його відсутністю (з переважанням цитолітичного синдрому). Критерієм включення до групи з синдромом холестазу була наявність таких симптомів, як свербіння шкіри та підвищення активності сироваткової лужної фосфатази (ЛФ), холестерину та ß-ліпопротеїдів (ß-ЛП). Загальна кількість цієї групи склала – 25 хворих (23,1% всіх хворих на ГВГ). З них при ВГ А прояви холестазу мали місце у 13 хворих (26,5%), при ВГВ – у 12 (28,6). Наявність симптомів холестазу на протязі всього захворювання розглядалась, як холестатична форма ВГ (5 хворих). Значну більшість цієї групи – (20 осіб – 80,0)% склали хворі, у яких холестатичні прояви визначались короткочасно, тому розцінювалися, як ВГ з холестатичним компонентом [Блюгер А. Ф., 1984]. Серед хворих на ВГ з наявністю холестазу було 13 жінок (52,0%)  та 12 чоловіків (48,0%). Середній вік пацієнтів цієї групи склав 35,24±3,05 років.

До групи хворих на ХВГ увійшли 32 пацієнти у віці від 19 до 65 років. Згідно з міжнародною класифікацією хронічних гепатитів (Лос-Анджелес, 1994), була врахована етіологія гепатиту та активність процесу. Етіологія була встановлена  виділенням HBsAg, анти-HBcAg, анти-HCV методом імуно-ферментного аналізу та  визначенням у крові DNA HBV та RNA HCV методом полімеразної ланцюгової реакції. Виявлено: ХВГ С – у 12 (37,5%), ХВГ В – у 11(34,4%), ХВГ В+С –у 9 (28,1%) хворих. До дослідження були залучені тільки пацієнти з активністю патологічного процесу від мінімальної до вираженої. Серед хворих з ХВГ було 19 чоловіків та 10 жінок. Середній вік склав (39,34±1,89) років. За даними анамнезу в минулому ГВГ реєструвався у 15 (46,9%) з числа хворих на ХВГ. Всі обстежені мали анамнез захворювання тривалістю від 0,5 до 5 років. В окрему групу були виділені 9 хворих на  цироз печінки, пов'язаний із ВГ С та В+С, у стадії субкомпенсації та декомпенсації.

До дослідження також були залучені хворі з пухлинами ПДЗ, які потрапили до відділень вірусних гепатитів МКЛ № 21 у зв’язку з жовтяницею та підозрою на ВГ. Наявність та локалізацію пухлин, що призвели до обтураційної жовтяниці всім хворим було підтверджено в різні терміни  методом ендоскопічної ретроградної холангіопанкреатографії (ЕРХПГ). У всіх пацієнтів цієї групи одним з провідних синдромів був холестаз. В даній групі було 28 чоловіків (87,5%) та 4 жінки (12,5%). Середній вік хворих склав (60,75±1,78) років. Причинами розвитку обтураційної жовтяниці у досліджуваних пацієнтів був: рак голівки підшлункової залози – у 22 хворих (68,8%); великого дуоденального соску – у 3 хворих (9,4%), воріт печінки – у 3 хворих (9,4%); жовчного міхура – у 4 хворих (12,5 %) означеної групи.

Лабораторне обстеження хворих на ГВГ доброякісного перебігу проводилось в період розпалу хвороби - на висоті жовтяничного синдрому та у періоді ранньої реконвалесценції. Обстеження хворих на ХВГ проводилось при госпіталізації – на висоті активності та при зниженні активності гепатиту. Хворих на онкологічні захворювання, що призвели до обтураційної жовтяниці та хворих на цироз обстежено одноразово, на висоті клінічних проявів.

Загальноприйняті біохімічні, серологічні та вірусологічні дослідження проводились на базі біохімічної та вірусологічної лабораторії МКЛ №21.

Спеціальні біохімічні дослідження проводились на кафедрі біохімії, медичної та фармацевтичної хімії Дніпропетровської державної медичної академії. Вміст ОР визначали методом ракетного електрофорезу в 1% агарозному гелі, що містив моноспецифічну поліклональну антисироватку до цього глікопротеїну. Кількісне визначення білка проводили за виміром площі преципітаційного піку [Стєклєньова Н. І. та ін., 2006]. Для оцінки співвідношення глікоформ ОР проводили перехресний афінний імуноелектрофорез (ПАІЕ) у 1% агарозному гелі в присутності: у першому напрямку лектину Canavalia ensiformis (ConA) або Phaseolus vulgaris (PHA-L) («Лектинотест», Україна), у другому – антитіл до ОР. Взаємодія ОР з ConA призводить до появи трьох піків: 1(ОР-1) представлений молекулами, що не зв'язуються з лектином, 3 (ОР-3) – молекулами із сильною спорідненістю до лектину, та 2 (ОР-2) – проміжний варіант із слабкою спорідненістю. При взаємодії з PHA-L утворюється два піка: ОР-1а – фракція, що не зв'язується і ОР-2а – фракція, що зв'язується з лектином.

 Вміст СМ визначався за скрінінговим методом [Габриэлян Н. И. и др., 1983], основаним на звільненні сироватки крові від високомолекулярних пептидів та білків з використанням трихлороцетової кислоти та кількісному визначенні в отриманій після центрифугування надосадовій рідині рівня середньомолекулярних пептидів по поглинанню у монохроматичному світовому потоці при довжині хвилі 254 нм (Спектрофотометр СФ-26).

Рівень ІЛ-1ra , IЛ-6 та вміст у сироватці крові СА 19-9 визначався за методом твердофазного імуноферментного аналізу набором реагентів «Рецепторный антагонист ИЛ-1-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-6-ИФА-БЕСТ» та «СА 19-9-ИФА-БЕСТ» (ТОВ «Вектор Бест», Росія).

Статистична обробка матеріалів досліджень проводилась з використанням методів біостатистики за допомогою пакетів програм EXCEL-2003 (№ 74017-641-9475201-57429), БИОСТАТИСТИКА 4.03. Основні статистичні характеристики включали: кількість спостережень (n), середню арифметичну (M), похибку середньої величини (m), стандартне відхилення (SD), відносні показники. Оцінка достовірності відмінностей середніх величин і дисперсій виконувалася за критеріями Стьюдента (t), Манна-Уітні (U), Фішера (F), відносних величин – за критерієм Хі-квадрат Пірсона (c2), множинне порівняння – за результатами однофакторного дисперсійного аналізу з розрахунком сили впливу (К²) окремих факторів на результативну ознаку. Взаємозв'язок між ознаками оцінювався за коефіцієнтами рангової кореляції Спірмена (r) і коефіцієнтом сполучення (j). Критичне значення рівня значимості (р) приймалося рівним 0,05 [Гланц С., 1998, Лапач С. Н. и др., 2000, Реброва О. Ю., 2006]. Для диференційної діагностики використовувалась теорема Байєса і послідовний (секвенціальний) аналіз Вальда [Гублер Е. В., 1978].

Результати власних досліджень. За результатами проведених досліджень визначено, що вміст ОР у сироватці крові хворих на ГВГ відрізнявся залежно від етіології гепатиту, періоду захворювання та ступеню важкості. У хворих на ВГ А у періоді розпалу захворювання цей показник у середньому складав (1,48±0,09) г/л і був значно вищим (p<0,001), ніж  показник здорових осіб (0,68±0,10) г/л  та показники, отримані в аналогічний період у групах хворих на ВГ В (0,99±0,08) г/л (p<0,001) та ВГС (0,97±0,06) г/л (p<0,001). Найбільша концентрація ОР визначена при ВГ А середньої важкості (1,63±0,12)  проти (0,99±0,11) г/л (p<0,001) при важкому гепатиті та (1,36±0,16) г/л (p<0,08) при гепатиті легкого ступеню важкості. З початком реконвалесценції у хворих на ВГ А порівняно з періодом розпалу відзначалось поступове зниження рівню ОР з (1,48±0,09) до (1,09±0,07) г/л (p<0,01) але цей показник залишався вищим, ніж у групі здорових людей (0,68±0,10) г/л (p<0,001).

При обстеженні хворих на ГВГ В (з доброякісним перебігом хвороби) у періоді розпалу захворювання середній вміст ОР у сироватці крові дорівнював (0,99±0,08) г/л та також перевищував цей показник у здорових людей (0,68±0,10) г/л (p<0,05). У хворих на фульмінантну форму ВГ В вміст ОР коливався від 0,029 до 0,200 г/л і був у середньому значно нижчим (0,14±0,05) г/л за отримані результати, як у здорових осіб (0,68±0,10) г/л (p<0,001), так і у групах хворих з середнім (1,05±0,10) г/л (p<0,001) та важким (0,84±0,13) г/л (p<0,001) ступенем ВГ В. У динаміці при ВГ В зниження  середнього вмісту ОР у порівнянні з періодом розпалу не було статистично значимим (0,93±0,08) проти (0,99±0,08) г/л (p>0,50). Рівень ОР залишався вищим, ніж у здорових людей (0,68±0,10) г/л (p<0,06). При важкому перебігу ВГ В в означений період вміст ОР, навпаки, дещо  збільшився: з (0,93±0,10) до (1,03±0,10) г/л (p>0,50).

При ВГ С в періоді розпалу захворювання  середній вміст ОР склав (0,97±0,06) г/л та, як і при ВГ А та ВГ В був підвищеним у порівнянні зі здоровими особами (p<0,05). У динаміці спостерігалось незначне зниження рівня ОР до (0,83±0,07) г/л (p>0,10).

Проведений аналіз залежності вмісту ОР від наявності синдрому холестазу при ВГ А та ВГ В довів, що на висоті проявів холестазу цей показник у середньому становить (1,54±0,13) г/л  та є значно більшим у порівнянні, як із групою здорових осіб (p<0,001), так і з групою хворих на ВГ без холестазу (0,91±0,12) г/л (p<0,01). Кореляційний зв’язок між ступенем підвищення ОР і наявністю синдрому холестазу був помірним (r=0,33; p<0,001).

У групі здорових людей було проаналізовано зв’язок між вмістом ОР та статтю. Вірогідної різниці між середніми показниками ОР у чоловіків та жінок в результаті проведених досліджень не було виявлено (p>0,90).

У результаті досліджень визначені зміни у співвідношенні глікоформ ОР при ГВГ. Так у періоді розпалу захворювання визначено значне зниження ОР-3 у порівнянні із здоровими особами: (1,97±0,29) проти (8,15±0,38)% (р<0,001). Відповідно зросла відносна кількість ОР-1: (58,20±0,67) проти (42,54±0,98)% (р<0,001) у контролі. Визначені також зміни співвідношення PHA-L-зв'язуючих фракцій орозомукоїду в періоді розпалу вірусних гепатитів. Зафіксовано зниження ОР-1а до (7,04±0,72) проти (13,44±0,77)% (р<0,001) та відповідне зростання ОР-2а, до (93,02±0,73) проти (86,56±0,77)% (р<0,05)%. Це свідчить про значне зниження кількості двохантенних гліканів та пропорційне йому підвищення вмісту три- та тетраантенних структур у складі ОР при ГВГ. Аналіз глікоформ ОР у період розпалу захворювання при ГВГ залежно від етіології показав, що всі показники у групах ВГ А, ВГ В і ВГ С достовірно (p<0,001) відрізнялись від рівня у здорових людей. Водночас, не встановлено статистично значимої відмінності при ВГ А та ВГ В, як у співвідношенні ConA-зв'язуючих фракцій ОР-3, ОР-2 та ОР-1 (p>0,10 для всіх фракцій), так і PHA-L-зв'язуючих фракцій: ОР-1а та ОР-2а (p>0,10 для всіх фракцій). Проте, при ВГ С ці показники суттєво (р<0,001) відрізнялись від співвідношень ОР-3, ОР-1а та ОР-2а у групах хворих з ВГ А та ВГ В, що, можливо, пов’язано з відсутністю важких форм при гепатиті даної етіології.

У періоді реконвалесценції визначено поступове зростання фракції ОР-3, але не до повного її відновлення. Рівень означеної фракції залишався нижче цього показника групи здорових людей у 3,9 рази: (2,07±0,27) проти (8,15±0,38)% (р<0,001), але був вище у порівнянні з показником у періоді розпалу (1,97±0,29)% (р<0,01). Схожі зміни фіксувалися і у співвідношенні PHA-L-зв'язуючих фракцій ОР. Так відносний вміст ОР-1а повільно зростав у динаміці (р>0,20) та залишився меншим за групу здорових людей: (8,20±0,61) проти (13,44±0,77) % (р<0,001).

При окремому аналізі груп хворих на ВГ А і В з наявністю та відсутністю синдрому холестазу визначені характерні відмінності. При ВГ без холестазу у сироватці повністю була відсутня фракція ОР-3 у той час, як при вірусних гепатитах, що супроводжувались холестазом, ця фракція реєструвалась на рівні (3,94±0,62)% але була майже удвічі нижчою, ніж у групі здорових людей: (8,15±0,38)% (р<0,001). Відповідно, відсоток ОР-1 при ВГ з наявністю холестазу був вищим,  ніж у здорових людей: (55,72±1,22) проти (42,54±0,98)% (р<0,001), але нижчим, ніж при ВГ без холестазу (67,30±3,04) (р<0,001). Відносний вміст ОР-1а в даній групі достовірно не відрізнявся від здорових людей: (13,26±0,88) проти (13,44±0,77)% (p>0,80), але був суттєво більшим, ніж у хворих на ВГ без холестазу (0,67±0,24)% (р<0,001), де зміни співвідношення фракцій ОР були найбільш показовими. Вміст ОР-2а при  ВГ, що супроводжувались холестазом, також практично не відрізнявся від здорових людей (86,75±0,82) проти (86,56±0,77)% (p>0,80). Визначено, що наявність холестатичних проявів прямо корелює зі збільшенням відсотку фракції ОР-3 (r=0,85; p<0,001) і ОР-1а (r=0,82; p<0,001), зворотно – зі збільшенням  відсотку ОР-2а (r=-0,86; p<0,001) і ОР-1 (r=-0,35; p<0,05).

При визначенні вмісту прозапального ІЛ-6 та протизапального ІЛ-1ra, з якими пов’язують відповідно індукцію та інгібірування синтезу ОР, встановлено, що у періоді розпалу захворювання при ГВГ у порівнянні зі здоровими особами підвищується рівень, як ІЛ-6, так і в більшій  мірі ІЛ-1ra. Найбільші зміни вмісту ІЛ-1ra, у порівнянні зі здоровими людьми зафіксовані в цей період у хворих на ВГ А: (480,10±58,58) проти (46,00±1,46) пг/мл (р<0,001). При ВГ В вміст IЛ-1ra становив (333,62±64,02) пг/мл і також перевищував показник групи здорових осіб (р<0,001), але був меншим, ніж у групі хворих на ВГ А (р<0,09).

Рівень IЛ-6 при ГВГ В, навпаки, був значно вищим, ніж при ВГ А (14,28±1,94) проти (8,59±0,97) пг/мл (р<0,05) та був максимальним серед всіх хворих з доброякісним перебігом ГВГ. При ВГ С рівень IЛ-6 був більшим, ніж у здорових людей (13,76±2,25) проти (4,45±1,33) пг/мл (р<0,001), статистично не відрізнявся від аналогічного показника при ВГ В (p>0,80) і був суттєво вищим, ніж при ВГ А (p<0,05).

Вміст IЛ-6 при фульмінантному ВГ В коливався у межах від 10 до 30 пг/мл і в усіх випадках перевищував норму (р<0,05). Проте, показник IЛ-1ra (діапазон коливань – від 30 до 70 пг/мл) був значно нижчим  ніж у групі хворих з доброякісним перебігом хвороби (р<0,001) та практично не відрізнявся від середнього показника здорових людей (p>0,80). Таким чином, співвідношення вмісту протизапального IЛ-1ra до прозапального цитокіну IЛ-6 при фульмінантному гепатиті було мінімальним та дорівнювало 2,2 проти 23,4 при доброякісному перебігу ВГВ.

У періоді реконвалесценції при всіх ГВГ мало місце суттєве зниження рівню IЛ. У порівнянні з періодом розпалу, найбільша динаміка зниження вмісту IЛ-1ra спостерігалася при ВГ А - на 79,1% (р<0,001), при ВГ В - на 54,1% (р<0,001), а при ВГ С - на 57,5% (р<0,001). У періоді реконвалесценції рівень даного ІЛ залишався в усіх групах підвищеним у порівнянні зі здоровими особами. Максимальне перевищення визначено при ВГ В (153,11±32,88) пг/мл - у 3,3 рази вище, ніж у здорових людей (р<0,001), а мінімальне при ВГ А (100,18±9,09) пг/мл - у 2,2 рази вище показника здорових людей (46,00±1,46) пг/мл (р<0,001).

Вміст IЛ-6 знизився в цей період захворювання на 38,9% (р<0,01) при ВГ А; на 27,7% при ВГ В (р>0,10) та на 48,7% при ВГ С (р<0,01). Таким чином, зниження IЛ-6 в динаміці захворювання при ВГ В було значно меншим, ніж при ВГ С та ВГ А. В періоді реконвалесценції вміст означеного ІЛ найменш відрізнявся від контролю в сироватці крові хворих на ВГ А (5,25±0,41) (p>0,50), у той час, як при ВГ В ця відмінність була максимальною (9,07±0,91) проти (4,45±1,33) пг/мл (р<0,01).

Не визначено достовірної кореляційної залежності показників IЛ-1ra, IЛ-6 з ОР при ГВГ в різні періоди захворювання (p>0,05).

Вміст СМ у періоді розпалу захворювання статистично значимо (p<0,01-0,001) підвищується в сироватці крові всіх хворих на ГВГ. При цьому рівень підвищення залежить від ступеню важкості гепатиту – за результатами дисперсійного аналізу сила впливу К²=0,16 (F=9,45; р<0,001).

Найбільше підвищення концентрації СМ у порівнянні з контролем визначено  при ГВГ важкого перебігу (0,30±0,02) проти (0,12±0,02) ОД. опт. щільності (р<0,001), причому тільки при ВГ А цей показник достовірно перевищував відповідні значення при середньому та легкому ступенях важкості захворювання: (0,29±0,02) проти, відповідно (0,23±0,02) та (0,21±0,02) ОД опт. щільності (р<0,05). Не визначено статистичних відмінностей на висоті захворювання при порівнянні вмісту цих сполук при гепатитах різної етіології відповідного ступеню важкості (p>0,20). У періоді розпалу ГВГ визначений зворотний кореляційний зв'язок між вмістом ОР та СМ (r=-0,33; p<0,01). У періоді  ранньої реконвалесценції середній рівень СМ також не залежав від етіології гепатиту (p>0,10). Концентрація їх достовірно знизилась в усіх підгрупах (р<0,05-0,001), наблизившись до показника здорових людей (0,12±0,02) лише при легкому перебігу захворювання (0,14±0,01) ОД опт. щільності (p>0,10). Водночас, при ГВГ середньоважкого та важкого перебігу у ці терміни зниження рівня СМ значно затримувалось, статистично відрізняючись від здорових людей: відповідно (0,18±0,02) та (0,19±0,01) ОД опт. щільності (р<0,05), що може свідчити про затягування детоксикаційних процесів.

У результаті проведених досліджень визначено, що рівень ОР у сироватці крові хворих на ХВГ на висоті активності складав у середньому (0,82±0,05) г/л, дещо перевищував показник здорових осіб (0,68±0,10) г/л (p>0,05), переважно за рахунок ХВГ В (1,00±0,11) г/л (р<0,05). При ХВГ С і ХВГ В+С у цей період статистичного підвищення вмісту ОР у порівнянні з групою здорових людей не було: відповідно (0,73±0,06) та (0,71±0,06 ) проти (0,68±0,10) г/л  (p>0,05). При цирозі печінки вміст ОР склав (0,47±0,07) г/л та був значно нижчим, як у порівнянні із групою здорових людей (0,68±0,10) г/л (р<0,05), так і у порівнянні з показниками груп хворих на ХВГ В, С, та В+С, як на висоті активності: відповідно (1,00±0,11), (0,73±0,06) та (0,71±0,06 ) г/л (р<0,05), так і при зниженні активності гепатиту: відповідно (0,77±0,09), (0,72±0,07) та (0,65±0,06) г/л  (р<0,05 в усіх групах).