ВИДІЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІЛКОВИХ ЧИННИКІВ, ЩО ЗВ’ЯЗУЮТЬ ІНСУЛІН В КРОВІ ЛЮДЕЙ, ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ



title:
ВИДІЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА БІЛКОВИХ ЧИННИКІВ, ЩО ЗВ’ЯЗУЮТЬ ІНСУЛІН В КРОВІ ЛЮДЕЙ, ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ
Альтернативное Название: ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ, связывающие инсулина в крови ЛЮДЕЙ, БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Тип: synopsis
summary:


Матеріали та методи дослідження. У роботі використано сироватки крові людей, хворих на ЦД-1 та ЦД-2, які проходили курс лікування у відділеннях клінічної фармакології та клінічної діабетології Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка, а також сироватки крові здорових людей, що були отримані в Київському міському центрі крові.



Розробленим методом ІФА досліджено вміст ІА та ІАА в сироватці крові 438 хворих на цукровий діабет типу 1 (ЦД-1), 188 хворих на цукровий діабет типу 2 (ЦД-2), яких лікували препаратами інсулінів, та 104 хворих на ЦД-2, які не отримували інсулінів, а також 194 донорів. Крім того, досліджено вміст ІА та ІАА в сироватці крові 130 дітей віком від 5 до 16 років.  35 з них входили до групи ризику захворювання на ЦД-1, 30 дітей були хворі на ЦД-1 та 65 здорових.



 Для відокремлення ІА та ІАА від інших білків, що зв’язують інсулін в крові людей проводили поетапну афінну хроматографію сироваток спочатку на сорбентах з напівсинтетичним (“Ho­echst”) або рекомбінантним людським інсуліном (“Eli Lilly), а потім – на сорбентах з білком А (або G). Як тверду фазу використовували АН-агарозу 4В та BrCN-се­фа­ро­зу 4В. Інсуліновий сорбент з BrCN-сефарозою 4В готували за методом [Я. Туркова, 1980]. Ці дослідження проведені в “ручному” режимі та на хроматографі BioRad (Biologic LP). Отримані хроматографічні фракції досліджували методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) [U. Laemmli, 1970] і визначали вміст ІА та ІАА опрацьованим методом ІФА.



Принцип розробленого методу ІФА полягає в тому, що ІА та ІАА з сиро­ватки крові зв’я­зу­ю­ть­ся з інсуліном, фіксованим на полісти­ро­ловому планшеті. З утвореним комплексом антиген-антитіло взаємодіє кон’югат – моноклональні антитіла (МКА) до імуноглобулінів G лю­дини, мічені перок­сидазою хрону. Після вилучення незв’я­за­но­го кон’югату в лунки планшета вносять прояв­ник – розчин, який містить субстрат та один із хромогенів о-фе­ні­лен­ді­а­мін (ОФД) або тетраметилбензидин (ТМБ). Оптичну густину (ОГ) кінцевих продуктів субстратно-ферментативної реакції визначали за допомогою ридера “Multiskan EX” (Фінляндія) у двохвильовому режимі: для ОФД – при 492 нм та 620 нм, а для ТМБ – 450 нм та 620 нм. Верхню границю норми – граничне значення (ГЗ) – визначали як середнє значення ве­ли­чин ОГ для сироваток практично здорових людей плюс п’ять зна­чень середньо­квадратичного відхилення. Сироватки, для яких значення ОГ перевищували показник ГЗ, виз­на­чали як позитивні. Враховуючи рекомендації ВООЗ, результати дослідів представляли також у вигляді співвідношення значень ОГ зразків сироваток до ГЗ в системі (ОГ/ГЗ).



Специфічність розробленого імуноферментного методу розраховували за формулою: С = Н / Н+ХП х 100 %, де С – специфічність,  Н – кількість негативних результатів ІФА, ХП – кількість хибно-позитивних результатів ІФА [D. Schochetman, S. George, 1992].



Чутливість розробленого імуноферментного методу розраховували за формулою: Ч = П / П+ХН х 100 %, де  Ч – чутливість, П – кількість позитивних результатів ІФА, ХН – кількість хибно-негативних результатів ІФА [D. Schochetman, S. George, 1992].



Коефіцієнт варіації (КВ) між результатами визначення ОГ після постановки ІФА в лунках одного планшета та між різними планшетами обчислюють за формулою: КВ = s / Хсер. x 100 %, де s – середньоквадратичне відхилення, Хсер. – середнє арифметичне значення ОГ всіх досліджуваних зразків [В.В. Меншиков,1997].



Тест-систему “ІФА-АТ-інс” порівнювали з комерційними наборами для визначення ІА (ІАА): імуноферментним – “Anti-insulin ORG-520” (“ORGen­­tech”, Німеч­чина) та радіоімунним – “IA-AIA CIS biointe ational” (Фран­­­ція). 



При статистичній обробці одержаних даних використано значення середньої арифметичної, стандартної похибки, середньоквадратичного відхилення. Вірогідність визначали за непараметричним методом статистики  з використання критерію χ2  [Бабич П.Н., 2004].



Результати досліджень,  аналіз їх та узагальнення. Білки, одержані після хроматографії на колонці з інсулін-сефарозним сорбентом  сироваток  крові донорів і хворих на ЦД-1 та ЦД-2, досліджували методом електрофорезу в 15 % ПААГ за умов відновлення.


 


Обновить код

Заказать выполнение авторской работы:

The fields admited a red star are required.:


Заказчик:


SEARCH READY THESIS OR ARTICLE


Доставка любой диссертации из России и Украины