ТОКСИКОДИНАМІКА ТА ТЕРАПІЯ ГОСТРИХ ІНГАЛЯЦІЙНИХ ОТРУЄНЬ ЕПОКСИДНИМИ СМОЛАМИ (експериментальне дослідження) : Токсикодинамика И ТЕРАПИЯ ОСТРЫХ ИНГАЛЯЦИОННЫХ ОТРАВЛЕНИЙ эпоксидной смолы (экспериментальное исследование)

summary

Матеріали та методи дослідження. У роботі досліджувалися діанові ЕС марок ЕД-20 (ГОСТ 10587-84) і Е-40 (ОСТ 6-10-416-77), їх найбільш небезпечний в токсикологічному відношенні компонент – ЕХГ – і його метаболіт –
3-хлор-1,2-пропандіол.

 В експерименті використано 4147 тварин, у тому числі 1325 білих нелінійних щурів, 2647 щурів лінії Вістар, 96 білих безпородних мишей і
79 мишей лінії BALВ/c. Всі тварини були статевозрілі, обох статей з масою тіла 160-240 г – щурі і 19-28 г – миші. Для досліду тварин брали після проходження карантину протягом 20-25 днів.

Інгаляційну затравку лабораторних тварин (білих щурів) леткими компонентами ЕС здійснювали динамічним способом при 4-годинній експозиції
(И.В. Саноцкий, 1970; А.П. Яворовский, 1990) в нашій модифікації (І.Ю. Висоцький, К.Г. Калікін, 1991) і статичним способом в умовах 30-хвилинної експозиції ЕХГ за методикою В.Д. Лук`янчука (1979). При вивченні порівняльної токсичності ЕХГ і його метаболіту 3-хлор-1,2-пропандіолу ці речовини вводили перорально у вигляді 1-5% розчинів.

Токсикометричні параметри досліджуваних речовин розраховували за допомогою методу найменших квадратів для пробіт-аналізу кривих летальності (В.Б. Прозоровский, 1962), а також експрес-методу (В.Б. Прозоровский и др., 1978) і методу «однієї точки» за Van der Vaerden (1970). Протягом
14 днів фіксували клінічну картину інтоксикації та загибель тварин.

Вміст летких продуктів у повітрі затравної камери регулювали за рахунок зміни наважки досліджуваної речовини, температури нагрівання і режиму повітряного обміну. Як провідний і характерний компонент летких компонентів ЕС ЕД-20 і Е-40 був взятий ЕХГ. Концентрацію парів ЕХГ у повітрі затравної камери визначали за методом М.С. Биховської та ін. (1966).

Для визначення порога гострої (Lim_ac) і порога специфічної (Lim_sp) загальнотоксичної дії ЕС у тварин після 4-годинної затравки реєстрували ректальну температуру тіла за допомогою електротермометра ТПЕМ-1, вміст SH-груп у крові (P.D. Boyer, 1954), відносну масу печінки, активність аланін-амінотрансферази (АлАТ) в сироватці крові (S. Reitman, S. Francel, 1977) і час виведення бромсульфалеїну (БСФ) з жовчю (Л.И. Израйлет и др., 1976). Розраховували зони гострої (Z_ac) і специфічної (Z_sp) дії. Про функцію нирок робили висновок за величиною добового діурезу, концентрацією сечовини у крові і хлоридів в сечі (ВІО-LA-TEST, Чехія).

Вивчення впливу добових і сезонних біоритмів на токсичність ЕХГ і ЕС при смертельних (ЛД₅₀, ЛК₅₀) і близьких до порогових (1/10 ЛД₅₀, ЛК₅₀) рівнях впливу проводили на окремих групах тварин, яких утримували у звукоізольованих з контрольованою температурою штучно освітлюваних кімнатах при співвідношенні світлого і темного періодів 12:12. Дослідження проводили з
4- (ЕХГ) і 12-годинними (ЕС) інтервалами, а також в середині зими, весни, літа і осені о 12-й годині. ЕХГ вводили в організм перорально у вигляді 5% олійного розчину, а леткі компоненти ЕС – інгаляційно протягом 4 годин.

Дослідження процесів зв`язування ЕХГ сироваткою крові, а також окремими білковими фракціями сироватки, такими, як альбумін (виробництва фірми «Reanal») і g-глобулін (виробництва INCSTAR Corporation), проводили методом рівноважного діалізу у модифікованому А.І. Луйком і В.Д. Лук`янчуком (1985) апараті С.І. Чегера (1975). Розрахунок кількісних параметрів комплексоутворення (константа асоціації – К_а і число місць зв`язування – N) здійснювали графічним методом Скетчарда (1984). Визначення концентрації ЕХГ в сироватці крові і сечі проводили за методикою Г.К. Гризунової та ін. (1993).

Скринінг потенціальних антиоксидантів проводили в дослідах in vitro на моделі ініційованого окислення метилових ефірів ненасичених жирних кислот (H. Fe andez, 1982), джерелом яких був «Лінетол». Аліквоти інкубаційного середовища відбирали в динаміці через 10, 20, 30 і 40 хвилин з моменту ініціювання перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) Fe²⁺. Про інтенсивність пероксидації лінетолу робили висновок за вмістом продуктів ПОЛ, які реагували з
2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (H. Okhawa, 1979).

Первинний фармакологічний скринінг потенційних детоксикуючих засобів проводили на моделі гострої пероральної інтоксикації ЕХГ (ЛД₅₀-ЛД₁₀₀) як серед відомих лікарських засобів з різними механізмами дії, так і оригінальних органічних сполук різної будови. Ефективність препаратів оцінювали за показниками виживання і термінів загибелі тварин.

Експериментальною моделлю гострого токсичного ураження печінки був патологічний процес, що розвивався у тварин у результаті однократного
4-годинного інгаляційного динамічного впливу леткими компонентами ЕС
ЕД-20 в концентрації, що становила 1/3 ЛК₅₀ за ЕХГ (120-140 мг/м³) .

Препарати застосовували за лікувально-профілактичною схемою: кверцетин внутрішньошлунково в дозі 350 мг/кг (ЕД₅₀), флавінат – внутрішньом`язово
4 мг/кг (ЕД₅₀), ліпін – внутрішньоочеревинно 0,8 ммоль/кг (ЕД₃₀), ацетилцистеїн – внутрішньоочеревинно 450 мг/кг (ЕД₅₀), омепразол – внутрішньоочеревинно 50 мг/кг відповідно за 3; 1; 5; 0,5; 0,5 і 1 годину до початку затравки і через
5 хвилин після її закінчення. ЕД₅₀, ЕД₃₀  та індекс терапевтичної ефективності (ІТЕ) досліджуваних лікарських засобів визначали в умовах їх профілактичного введення за процентом виживання тварин на моделі гострої інгаляційної статичної 30-хвилинної затравки білих щурів ЕХГ (ЛК₅₀-ЛК₁₀₀) – за методикою
Б.М. Штабського (1980). Крім ізольованого введення речовин, застосовували такі їх комбінації: ацетилцистеїн + кверцетин, ацетилцистеїн + ліпін, ацетилцистеїн + флавінат і кверцетин + ліпін.

З метою вивчення індукції ферментів глутатіон-S-трансферази (Г-S-Т) і епоксидгідролази (ЕГ) кверцетин тваринам вводили 1 раз на день внутрішньошлунково по 100 мг/кг (5 днів); омепразол – внутрішньоочеревинно по
50 мг/кг (7 днів) і клофібрат – внутрішньошлунково по 200 мг/кг (2 дні).

Високомолекулярні сполуки (ВМС) вводили у вигляді 5-10% водних розчинів по 300 мг/кг маси перорально або 100 мг/кг маси внутрішньоочеревинно за 30 хвилин до і через 5 хвилин після отруєння ЕХГ. Активність препаратів оцінювали за виживанням, ІТЕ і термінами загибелі тварин.

Ентеросорбенти – карбовіт і карбовіт-М – вводили внутрішньошлунково за допомогою зонда з розрахунку 100 мг/100 г маси тіла за 1 годину до отруєння леткими компонентами ЕС. ІТЕ ентеросорбентів розраховували при їх внутрішньошлунковому введенні в дозі 100 мг/100 г маси за 1 годину до або через 1 годину після інтоксикації 5% олійним розчином ЕХГ в дозах, необхідних для визначення ЛД₅₀ ЕХГ.

Динаміку вмісту аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) у печінці визначали методом T. Sato та ін. (1963). Неорганічний фосфат (Ф_н) визначали за Delori в модифікації В.А. Григор`євої (1958), а рівень нікотинамідних коферментів (НАД+НАДФ, НАДН₂+НАДФН₂) – флуориметрично (W. Perlzweig, 1947).

Активність Г-S-Т у печінці визначали за утворенням комплексу глутатіону з 1,2-дихлор-4-нітробензолом (Ю.В. Хмелевський та ін., 1986), ЕГ – за рівнем фенілетиленгліколю (А.Е. Кранаускас, 1986), а g-глутамілтрансферази (g-ГТ) – за вивільненням п-нітроаніліну ( BIO-LA-TEST, Чехія).

Стан процесів ПОЛ у тварин після гострої інтоксикації леткими компонентами ЕС оцінювали за інтенсивністю спонтанної хемілюмінесценції (ІСХ) і активованої хемілюмінесценції (ІАХ), які реєстрували на хемілюмінометрі ІХЛ-1 (А.И. Журавлева, 1983), за вмістом у печінці рівня первинних продуктів ліпопероксидації – дієнових кон`югатів (ДК) (И.Д. Стальная, 1977) і кінцевого продукту ПОЛ, що реагує з ТБК, – малонового діальдегіду (МДА) (Z. Placer, 1968).

При вивченні функціонування окремих ланок антиоксидантної системи захисту організму визначали активність одного із ключових ферментів – каталази (КТ) – за методом М.А. Королюк (1988). Вміст феритину (ФР) у сироватці крові визначали радіоімунним методом за допомогою комерційного набору
«ІРМО-Феритин» (Білорусія), SH- і -S-S-групи – за методом P.D. Boyer (1954). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами оцінювали на основі  стану перекисної резистентності еритроцитів (ПРЕ) (О.Н. Воскресенский, 1982). Про стан монооксигеназної системи (МОС) печінки робили висновок за інтен-сивністю деметилювання амідопірину (О.Б. Леоненко, Т.А. Попов, 1981) і тривалістю гексеналового сну (В.Д. Розанова, 1979).

Для з`ясування молекулярних механізмів функціонування енергетичної і детоксикуючої систем печінки у досліджуваних умовах використовували метод ЕПР-спектрометрії. ЕПР-спектри записували на  спектрометрі марки Е-109 фірми «Varian» (США) в умовах низькотемпературної стабілізації (77⁰К). Досліджували ЕПР-сигнали з g-факторами: 2,25 – цитохром Р-450; 2,17 – марганцевмісні парамагнітні комплекси; 2,03 – нітрозильні комплекси заліза (НКЗ); 2,00 – вільні радикали (ВР); 1,94 – залізосірчані білки, або FeS-білки (ЗСБ); 1,97 – молібденовмісні парамагнітні комплекси (Я.И. Ажипа, 1983).

Вміст у плазмі крові основних метаболітів АК визначали радіоімунним методом. Рівень ЛТВ₄ вивчали з використанням комерційного набору Leucotriene B₄ assay system, ПГЕ₂ – набору ¹²⁵І-Prostaglandine E₂ assay system with magnetic separation («Amersham», Англія), ПГІ₂ – за допомогою системи
¹²⁵I-6-keto-prostaglandin F_1a, TXB₂ – ¹²⁵I-thromboxane B₂, ПГF_2a - ¹²⁵I-6-keto-prostaglan-din F_2a («Institute of isotopes», Угорщина). Дослідження концентрації АКТГ проводили з використанням набору Adrenocorticotropic hormone radioimmunoassay kit фірми «Cis» (Франція). Підрахунок радіоактивності проводили на сцинтиляційних лічильниках «Гама-12» і «Бета-1».

Визначення рівня вторинних месенджерів цАМФ і цГМФ у печінці проводили радіоімунним методом з використанням наборів «Cyclic AMP [¹²⁵I]RIA KIT» і «Cyclic GMP [¹²⁵I]RIA KIT» (Чехія). Вплив різних концентрацій ЕХГ на ендогенний біосинтез тканиною печінки in vitro ПГІ₂, ТХВ₂, цАМФ і цГМФ, а також можливості фармакологічної регуляції цих процесів у гепатоцитах вивчали за методом E. Oliw (1980) у модифікації А.Г. Кучеренко (1986). Для розрахунку досліджуваних продуктів ендогенного біосинтезу на 1 г білка у тканині печінки визначали білок за O.H. Lowry et al. (1951).

Гістологічні і електронно-мікроскопічні дослідження проводили за-гальноприйнятими методами. Ультратонкі зрізи для перегляду і фотографування в електронних мікроскопах фірм «GEM-III» (Японія) і «Philips» (Нідерланди) готували на ультратомі LKB-V (Швеція).

Визначення досліджуваних показників проводили протягом перших трьох-п`яти діб після отруєння.

Результати досліджень обробляли статистично з використанням комп`ютерної програми Microsoft Excel (США). Достовірність оцінювали на рівні значущості не менше 95% (Р£0,05) з використанням критерію t Стьюдента (А.В. Плохинский, 1970), а також точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (Е. В.Гублер, 1978).

Результати досліджень та їх обговорення. Внаслідок проведених токсикометричних досліджень встановлено, що ЕС ЕД-20 і Е-40 характеризуються високою токсичністю, незначними відмінностями видової чутливості експериментальних тварин, а леткий компонент ЕС – ЕХГ – є помірно токсичною при інгаляційному впливі і високотоксичною сполукою при внутрішньошлунковому введенні. У порівняльному аспекті ЕС ЕД-20 дещо більш токсична, ніж ЕС Е-40 (рис.1). Оскільки токсичність незатверділих діанових ЕС прямо залежить від епоксидного числа і обернено – від величини молекулярної маси і в`язкості (Н.И. Шумская, 1962; А.П. Яворовский, 1990), то виявлені нами відмінності у величинах ЛК₅₀ для ЕС ЕД-20 і Е-40 можна пояснити більшою молекулярною масою останньої.

Про важливу роль епоксидних груп у токсичності ЕС і ЕХГ свідчить встановлена нами значно більш висока ЛД₅₀ первинного метаболіту ЕХГ
3-хлор-1,2-пропандіолу порівняно з вихідною сполукою (табл. 1). Це пов`язано з перетворенням епоксигрупи ЕХГ під впливом ЕГ у дві гідроксильні групи (В.А. Кобляков, 1990; F. Oesch, 1982).