ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ НАПРАВЛЕННОЙ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА И СОПРОВОДИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛУЧЕВОГО ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ : ПАТОГЕНЕТИЧНЕ ОБҐРУНТУВАННЯ ЗАСТОСУВАННЯ СПРЯМОВАНОЇ ІНДУКЦІЇ АПОПТОЗУ ТА СУПРОВІДНОЇ ТЕРАПІЇ ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПРОМЕНЕВОГО ЛІКУВАННЯ ОНКОЛОГІЧНИХ ХВОРИХ

summary

Матеріал і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на 128 щурах-самцях лінії Wistar масою 180–240 г з підшкірно перевитою карциномою Герена (Guerin’s carcinoma). Трансплантацію пухлини здійснювали шляхом введення під шкіру 0,5 мл 20 % суспензії клітин пухлини Герена. Експеримент починали, коли розміри пухлинного вузла досягали в діаметрі 2,0–2,5 см.

Відповідно до поставлених завдань щурів-пухлиноносіїв розподілили за групами: 1) локальне рентгенівське опромінення пухлини (10,0 Гр);
2) в/м введення таксотеру «Рен-Пуленк Рорер» (6 мг/кг); 3) в/м введення етопозиду «Ебеве» (5 мг/кг); 4) локальне рентгенівське опромінення пухлини + таксотер; 5) локальне рентгенівське опромінення + етопозид; 6) щури-пухлиноносії – контроль.

Експерименти здійснювали відповідно до правил «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються в експериментальних і інших наукових цілях» (1986) і методичних рекомендацій “Біо-
етична експертиза доклінічних та інших наукових досліджень, що виконуються на тваринах” (Резніков О.Г. та ін., 2006).

Для визначення СФЛ в сироватці крові і тканинах використаний метод Блайя і Дайра (1959) з екстракцією ліпідів і розділенням СФЛ на класи (Dolgachev V. еt al., 2004). Кількісний вміст Ц визначали хроматографічно за методом March J.B., Weinstein D.B. (1966). Активність синтезу СФЛ визначали за допомогою міченого попередника – ¹⁴С–пальмітинової кислоти (2,07 Гбк/ммоль; Amersham, G. E. Healthcare, Великобританія). Радіоактивність проб вимірювали на лічильнику ВЕТА.

Вираженість апоптозу і променевого патоморфозу пухлини Герена визначали шляхом морфологічної оцінки на гістологічному і ультраструктурному рівнях за допомогою стандартних методів. Напівтонкі зрізи забарвлювали метиловим синім і підраховували кількість мітозів у полі зору світлового мікроскопа МБІ-6 (окуляр´10, об’єктив´20, бінокуляр´2,5). Ультратонкі зрізи забарвлювали за Рейнольдсом і досліджували під електронним мікроскопом ЕМ-125 (Сумське ВО «Електрон», Україна).

У клінічній частині роботи наведені результати дослідження 122 хворих у віці 37-65 років з місцево поширеним РГЗ, яке проведене на базі
Харківського обласного клінічного онкодиспансеру і ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва АМН України».

Оцінку ефективності розроблених методів неоад’ювантної ПТ з толерантною дозою таксотеру (I гр. хворих) і супровідної терапії (II гр. хворих) проводили у пацієнток з первинно неоперабельним РГЗ (IIБ-IIIБ ст.,
Т2-3N0-1M0 – T1-4N0-3M0) (67 хворих). У хворих на ранніх стадіях РГЗ (IIA-IIБ ст., T1N1M0 – T2N0M0) (55 хворих) проводили тільки дослідження закономірностей змін окремих систем гомеостазу. Референтну групу склали 25 практично здорових жінок адекватного віку (донори Харківського обласного центру служби крові).

Для порівняльного аналізу патоморфозу ПК при різних видах антибластомного лікування використаний архів морфопрепаратів професора Т.П. Якимової – патологоанатомічна лабораторія ДУ «Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва АМН України».

Досліджували закономірності змін показників ряду систем гомеостазу – перекисного окислення ліпідів і антиоксидантної системи, ліпідного обміну, системи гемостазу, а також вираженість ендотоксемії.

Оцінку динаміки онкопроцесу, візуалізацію безпосередніх результатів під впливом запропонованих схем комбінованого лікування проводили з використанням УЗД, а також морфологічних досліджень, останні проводили на матеріалі біопсії.

Методика проведення променевої терапії в класичному режимі хворим на РГЗ IIБ – IIIБ ст. Опромінення проводили на гамма-терапевтичних апаратах РОКУС-АМ, РОКУС-М дрібними класичними фракціями в режимі 2,0 Гр по 5 фракцій протягом тижня за програмою: на область онкологічного вогнища – СОД 60,0 Гр, на аксилярну область – СОД 45,0 Гр, а в разі наявності конгломерату лімфовузлів додавали 20,0 Гр з тим же режимом фракціонування; на над- і підключичну області та на парастернальну зону –СОД 40,0 Гр.

Методика проведення ПТ з толерантними дозами таксотеру хворим на РГЖ IIБ-IIIБ ст. ПТ з таксотером хворі отримували як передопераційну складову частину комбінованого антибластомного лікування. Хворим впродовж всього курсу ПТ 1 раз на тиждень за 24 години до опромінення внутрішньовенно крапельно вводили 20,0 мг таксотеру на 400 мл ізотонічного розчину NaCl (разова толерантна доза). Премедикацію проводили
дексаметазоном перорально 2 рази на день по 8,0 мг (16,0 мг на добу) протягом 3-х діб. Таксотер вводили на 2-гу добу після початку премедикації.

Методика проведення супровідної терапії. Використані препарати тваринного і рослинного походження – Біполан і Карінат, складові яких беруть участь у функціонуванні основних метаболічних систем. Метаболічний і терапевтичний ефекти Біполану зумовлює наявність в ньому фізіологічно важливих протеїнових комплексів, глікополіпептидів, мукопротеїнів, амінокислот, в т.ч. всіх незамінних, інсуліноподібних речовин, уронових і сіалових кислот, вуглеводів у вигляді гексоз, біогліканів; біогенних макро- і мікроелементів (Ca, P, K, Na, Mg, Mn, Fe, Cu, Cr, Zn, I, Se); вітамінів А, Е, РР, С, U і групи В; поліненасичених жирних кислот (Пат. №10463, Губанова А.Г., Пушкар С.М., 1996; Пат. №17362, Губанова А.Г., Пушкар С.М., 1997; Пушкар С.М., 2008).

Фітопрепарат Карінат – екстракт часнику – містить b-каротин, вітаміни Е, С. Має антиагрегантні, антитромботичні і імуномодулювальні властивості (Пат. № 2129874, Орехов А.Н., 1999).

Біполан приймали по 12 г (1 десертна ложка) 1 раз на день перед їжею; Карінат – по 1 капсулі 2 рази на день під час їжі. Обидва препарати призначали одночасно впродовж всього курсу ПТ.

Методика морфофункціональної оцінки променевого патоморфозу. Для морфологічного дослідження після оперативного видалення окремі ділянки злоякісної пухлини і лімфатичних вузлів фіксували в 10 % формаліні і після целоїдинової або парафінової проводки гістологічні зрізи забарвлювали гематоксилін-еозином і за методом Ван Гізона. Враховували мікроскопічні ознаки патоморфозу (дистрофічні зміни, мітотичну активність та ін.) (Якимова Т.П., 1986; 1995), а також макроскопічні характеристики.

Ультраструктурні зміни вивчали на ультратонких зрізах видаленої пухлини грудної залози (стандартний метод із забарвленням за Рейнольдсом - Harris J.R., 1991).

Кількісна оцінка апоптозних клітин. Підраховували апоптозний індекс (АІ) – кількість клітин з морфологічними ознаками апоптозу. Депарафіновані гістологічні зрізи промивали фосфатним буфером і забарвлювали барвником Hoechst-33342 (5 мг/мл). За допомогою флюоресцентного
мікроскопа підраховували кількість клітин з характерною для апоптозу «структурою» (конденсація ядра, фрагментація ядра і клітин, дискретні апоптичні тіла). Результати виражали в процентному відношенні апоптозно змінених клітин (з фрагментами ДНК, що флюоресціюють) на 100
досліджених клітин в полі зору. Рівень спонтанного апоптозу визначали в матеріалі біопсії нативних пухлин (92 випадки), а індукованого апоптозу – в клітинах видалених пухлин.

Ультразвуковий метод дослідження РГЗ. Для уточнення локалізації процесу, оцінки місцевого поширення пухлини, динаміки візуалізації процесу використовували метод ультразвукової діагностики (апарат для УЗД – Siemens G-50). За даними УЗД оцінювали безпосередні результати протипухлинного лікування – протипухлинний ефект (повна або часткова регресія, стабілізація процесу, прогресування процесу) (Maurel J. et al., 2005).

Методи визначення показників ПОЛ і АО-системи. Визначення показників ПОЛ і АО-системи проводили в плазмі крові і в еритроцитах, використовуючи останні як модель клітини. Про інтенсивність ПОЛ судили за рівнями його стабільних продуктів – дієнових кон’югатів (ДКпл, ДКер), які визначали за методом И.Д. Стальной в модифікації В.И. Львовской (1991), а також малонового діальдегіду за методом Uchiyma M. і Michara M. у модифікації А.И. Карпищенко (1997).

Стан АО-системи оцінювали за активністю АО-ферментів і АО-вітамінів. Активність АО-ферментів визначали: супероксиддисмутази (СОД) – за методом В.О. Костюка із співавт., (1990); каталази (К) – за методом М.А.Королюк (1988); глютатіонпероксидази (ГП) – за А.И. Карпищенко (1997); церулоплазміну (ЦП) – за методом Т.І. Мжельської та ін. (1989). АО-вітаміни визначали: аскорбінову кислоту (Віт. С) колориметричним методом (Сурай П.Ф., Ионов И.А., 1990); Віт. А та Е за методиками I.N. Thompson et al. (1974); П.Ф. Сурай, И.А. Ионова (1990).

Методи визначення ліпідного профілю. Рівень загального холестерину (ЗХ) і тригліцеридів (ТГ) визначали ферментативним методом за допомогою стандартних діагностикумів виробництва фірми Dia System Int., Німеччина. Ліпопротеїни високої щільності (ЛПВЩ) визначали в супернатанті після осадження ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) і ліпопротеїнів дуже низької щільності (ЛПДНЩ) за допомогою гепаринмарганцевого реактиву. У пробі супернатанту визначали ЛПВЩ на ФЕК (Рифаман Н. та ін., 1997; Климов А.Н. та ін., 1999). Розрахунок ТГ після послідовної обробки специфічними ферментами проводився за формулою:

ТГ (ммоль/л) = (Е зразка/ Е стандарту) ´ (концентрація стандарту),

де Е – екстинкція вимірюваних проб.

Зміни в системі гемостазу оцінювали за допомогою електрокоагулографічного методу (електрокоагулограф Н-333) (Беляков П.Д. та ін., 1982) з урахуванням наступних структурно-хронометричних параметрів: початок згортання – Т₁ (хв); мінімальна амплітуда (щільність фібринових згустків, що утворилися) – А_О (ум. од). Стан фібринолітичної активності оцінювали за рівнем сумарної і неферментативної фібринолітичної активності (Кудряшов Б.А. та ін., 1978). Для отримання інформації про можливість розвитку ДВС–синдрому використовували паракоагуляційні тести – етаноловий і протамінсульфатний (Карпищенко А.И., 1997).

Методи визначення ендогенної інтоксикації. Вираженість ендогенної інтоксикації встановлювали на підставі визначення в плазмі крові середньомолекулярних пептидів за методами Н.И. Габриэлян і В.Н. Липатовой (1984), Н.И. Габриэлян та ін. (1985) та циркулюючих імунних комплексів (Гриневич Ю.А., Алферов А.И., 1981).

Статистичну обробку проводили за допомогою пакету програм «Statistica» із застосуванням комплексного підходу: числове наведення даних за допомогою описових статистик; порівняння взаємозв’язаних і невзаємозв’язаних груп з використанням методів параметричної і непараметричної статистики (критерії Манна-Уітні, Стьюдента-Фішера, Вілкоксона); методи багатовимірної класифікації (кластерний аналіз); аналіз зв’язків за допомогою коефіцієнтів Пірсона і критеріїв Манна-Уітні, Стьюдента-Фішера, Вілкоксона (Гланц С., 1999).

Результати дослідження та їх обговорення. У виконаних нами дослідженнях показано, що в радіостійких ПК карциноми Герена при рентгенівському опроміненні пухлини спостерігається низьке накопичення проапоптозного ліпіду Ц (4,37±0,74 нмоль/мг білка проти 3,10±0,40 нмоль/мг білка в нативній пухлині) із зниженням активності його синтезу на 35% на тлі дворазового збільшення синтезу апоптознеактивного сфінгомієліну (СФМ).

Обрані як індуктори церамідного шляху апоптозу ПК препарати Таксотер і Етопозид збільшували вміст Ц в пухлинній тканині. При введенні таксотеру маса Ц збільшувалася більш ніж в 3 рази (10,2±1,2 нмоль/мг
білка проти 3,10±0,40 нмоль/мг білка, p<0,001). Збільшення маси Ц в пухлинній тканині корелює з підвищенням його рівня в сироватці крові
(18,62 нмоль/мг білка проти 6,06±0,48 нмоль/мг білка в контролі, p<0,001). Рівень СФМ в ПК також збільшується і вірогідно (на 40 %) перевищує контрольні показники. Ці дані дозволяють визначити, що накопичення Ц, індуковане таксотером, здійснюється не за рахунок механізму, пов’язаного з активацією сфінгомієліназ, субстратом яких є СФМ, а шляхом синтезу de novo.

При введенні етопозиду вміст Ц зростав більш ніж в 5 разів (17,5±1,90 нМоль/мг білка проти 3,10±0,40 нмольл/мг в контролі), при цьому кількість СФМ залишалася на рівні інтактної пухлини (35,42±12,48 нмоль/мг білка після введення етопозиду проти 30,91±6,50 нмоль/мг білка в контролі).

Для розуміння глибоких механізмів накопичення Ц в клітинах нативної пухлини і при введенні індукторів апоптозу найбільш адекватною є оцінка активності синтезу різних фракцій СФЛ після інкубації гомогенатів пухлини Герена з попередником синтезу СФЛ – [¹⁴С]-пальмітиновою кислотою. Введення щурам-пухлиноносіям етопозиду збільшувало до 140,8 % сумарну активність синтезу СФЛ (120884±2405 і 85852±2680 [імп. × (хв × г тканини)­^-1] в групах з введенням етопозиду і з нативною пухлиною відповідно).

Аналіз активності синтезу окремих фракцій СФЛ показав, що етопозид підсилював синтез Ц до 190,3% – 40173±1380 [імп. × (хв × г тканини)­^-1], СФМ до 153,3 % – 27760±1031 [імп. × (хв × г тканини)­^-1], ГЛЦ до 124,2 % – 21986±790 [імп. × (хв × г тканини)­^-1] і не впливав на процес накопичення продукту деградації [¹⁴С]-цераміду – [¹⁴C] сфінгозину (108,3% – 28579±1333 [імп. × (хв × г тканини)­^-1] в порівнянні з контролем). Висока активність синтезу СФМ (до 153,3% по відношенню до інтактної пухлини) при низькому рівні накопичення його маси в ПК (до 114,2% по відношенню до інтактної пухлини) підтверджує літературні дані про перетворення СФМ в Ц під впливом сфінгомієліназ, що активувалися (Sawada M. et al., 2000).

Отримані результати дозволили показати різні механізми накопичення Ц в ПК при дії таксотеру і етопозиду. Зростання вмісту Ц при введенні таксотеру здійснюється за рахунок синтезу Ц de novo; при введенні етопозиду накопичення Ц відбувається не лише за рахунок його синтезу de novo, а і в результаті перетворення СФМ на Ц одночасно із зниженням рівня деградації Ц, що підтверджується низьким вмістом сфінгозину (СФЗ)
(рис. 1). В цілому, цитостатики таксотер і етопозид є потужними індукторами накопичення в тканині пухлини відомого стимулятора апоптозу ракових клітин – Ц, що дозволяє застосовувати ці препарати в якості радіомодифікаторів.

Виявлене незначне, але статистично вірогідне (на 24,2 %) збільшення вмісту пропроліферативного СФЛ – ГЛЦ – на тлі високої активності синтезу [¹⁴С]-цераміду (190 % від норми) і більшого його накопичення в ПК (у 6 разів порівняно з контролем) можна розглядати як фізіологічну реакцію на високий рівень апоптозної церамідзалежної загибелі клітин. Відомо, що збільшення в клітинах синтезу і вмісту Ц супроводжується активацією, поряд із церамідазою, глюкозилцерамідази, яка каталізує перенесення UDP-глюкози на Ц з утворенням ГЛЦ (Bleicher R.J., Cabot M.C., 2002). Ці процеси розглядаються як підтримка певного співвідношення біологічно активних СФЛ (Ц, ГЛЦ), спрямованого на виживання клітини (Lucci A. et al., 1999).