СТЕРЕОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭПИЗОДИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА РАЗВИТИЕ НЕКОТОРЫХ ОТДЕЛОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

summary

Матеріали і методи досліджень. Дослідження було проведене в співпраці з інститутом медичних досліджень Northwick Park (Лондон, Великобританія) і науково-дослідним інститутом при дитячій лікарні Kosair (Луїсвілль, США).

Для досягнення мети та розв’язання задань дослідження був поставленний експеримент з використанням щурів лінії Sprague-Dawley. В цілому, в роботі було використано 48 щурів обох статей: 24 – в групі контролю і 24 в експериментальній групі. Профіль епізодичної гіпоксії задавався шляхом заміни кімнатного повітря в камерах апарату Oxycycler моделі А44ХO (Reming Bioinstruments, Нью Йорк, США) на газову суміш, що містить 10 % O₂ кожні 90 секунд  на протязі 24 годин на добу.  Тварини експериментальної групи піддавалися дії епізодичної гіпоксії з 10 по 25 день після народження, тоді як контрольна група знаходилися в сусідніх камерах в умовах циркулюючого кімнатного повітря. Одна третина тварин експериментальної і контрольної груп була виведена з експерименту з використанням перфузійної фіксації 4 % нейтральним розчином формальдегіду у віці чотирьох, восьми і двадцяти тижнів.

Після закінчення фіксації в розчині формаліну з мозку щурів з використанням скальпеля і диссекційного мікроскопа Wild Heerbrugg виділявся передній мозок, що містив кору і гіпокамп, і довгастий мозок, що містив амбігуальне ядро і ядро під'язикового нерва. З метою привнесення елементу систематичної випадкової вибірки відповідно до вимог стереологічних методів (R.E. Miles, P.J. Davy, 1976; A. Stuart, 1976), вищезгадані частини мозку щурів заливалися 2% розчином агару, нарізалися на блоки завтовшки в 1,97 мм і проводилися в парафін.

Виготовлені гістологічні зрізи товщиною 30 мкм поміщалися на гістологічні скельця, покриті 2 %  розчином 3-амінопропіл-триетоксілану (APTS). Готові зрізи забарвлювалися гематоксилином по Майєру, а також з використанням непрямого авідин-біотинового методу для імуногістохімічної візуалізації гліального фібрілярного кислого білка (ГФКБ) і білка нейрональної ізоформи синтази оксиду азоту (nNO-синтази).

Оцінка об'єму структур, щільності нейронів і кліток глії, об'єму ядер нейронів, а також загальної кількості нейронів і кліток глії в досліджуваних структурах проводилася за допомогою стереологічної морфометрії (методи Кавальері, нуклеатор та оптичний дисектор).  Об'єм структур оцінювався з використанням методу Кавальєрі, шляхом підрахунку відміток, співпадаючих з досліджуваною структурою на проектованому і оцифрованому гістологічному зрізі за допомогою апарату Canon FR100 і програми Histometrix версії 5.0. Оцінка об'єму ядер нейронів, чисельної щільності і загальної кількості нейронів і кліток глії проводилася за допомогою методу нуклеатора та оптичного дисектора, програми Histometrix версії 5.0, мікроскопа Leitz Laborlux S, іммерсійного об'єктиву Leitz NPL Fluotar 1.32 із збільшенням X100, мікрометрів Heidenhain MT60K і Heidenhain ND281A, відеокамери FVS CL600 і персонального комп'ютера Pentium III з відеокартою  Matrox Meteor 2.

Статистичний аналіз включав підрахунок коефіцієнта помилки (СЕ) для кожної стереологичної оцінки об'єму, щільності і кількості. Оскільки отримані дані мали нормальний розподіл, то статистичний аналіз впливу ХЕГ з урахуванням статі і віку тварини на динаміку змін морфометричних параметрів проводився шляхом порівняння контрольної і експериментальної груп з використанням трьохфакторного дисперсійного аналізу на основі програм Statistica версії 6.0 і Stata версії 9.0.

Результати власних досліджень та їх обговорення.  Дія ХЕГ призводила до зниження маси тіла самців, але не самок щурів, найбільш вираженому у віці 8 тижнів (322,25±8,02 грам, 245,50±4.86 грам, p<0,001), що узгоджується з експериментальними даними інших дослідників (A. Kanaan et al., 2006; M.L. Schwartz et al., 2004; Z. Simonova et al., 2003), затримкою у фізичному розвитку у дітей з ОАС (A.D. Everett, W.C. Koch, F.T. Saulsbury, 1987), і, видно, має багатофакторний патогенез, що включає дисфункцію гіпоталамо-гіпофізально-гонадної осі та виявляється у гіпогонадизмі, зниженному вмісті циркулюючого аналогічного інсуліну фактору росту-1 і гормону росту у сироватці крові та порушенні його секреції у відповідності з циркадним ритмом.

Тоді як ХЕГ не мала вираженого впливу на масу мозку та імунореактивність nNO-синтази в корі головного мозку тварин експериментальної групи, було відмічено зниження об'єму кори, особливо виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,87x10^-7м³±0,03x10^-7м³,  1,76x10^-7м³±0,04x10^-7м³, р=0,038), що виникає із-за ХЕГ-індукованих змін в об'ємі кортикального нейропілю. Кількість клітин глії в корі головного мозку зростала з віком тварин незалежно від статі з 1,82x10⁷±0,15x10⁷ в 4 тижня до 2,03x10⁷±0,06x10⁷ в 8 тижнів та 2,53x10⁷±0,79x10⁷ в 20 тижнів  (р<0,001). Крім того, дане дослідження встановило, що під впливом ХЕГ в корі головного мозку тварин віку 4 і 8 тижнів відбувається складна реорганізація кліток глії з підвищенням імунореактивності ГФКБ у самців щурів і зниженням ГФКБ і кількості клітин глії у самок (1,62x10⁷±0,12x10⁷; 2,12x10⁷±0,09x10⁷, p<0,019). Оскільки ранній постнатальний період є критичним часом для гліогенеза, і, особливо, олігодендрогліогенеза, подібні зміни можуть приводити до довготривалого порушення мієлінізації і лежати в основі функціональних дефіцитів що відмічаються у щурів під впливом ХЕГ.

Дані, приведені в цій роботі, свідчать про зростання об'єму ядер нейронів в корі головного мозку з віком, незалежно від статі тварин, з 188,29x10^-16м³±6,61x10^-16м³ в 4 тижні до 204,25x10^-16м³±2,66x10^-16м³ в 8 тижнів і 254,25x10^-16м³±6,01x10^-16м³ в 20 тижнів (р<0,001), який корелював із зростанням цього показника в інших вивчених структурах головного мозку щурів. Проте ХЕГ не призводила до зміни цього показника нейронів кори головного мозку.

Дисперсійний аналіз виявив підвищення кількості нейронів в корі головного мозку щурів всіх вікових груп під впливом ХЕГ, особливо помітне у самців у віці 4 тижнів (3,02x10⁷±0,06x10⁷, 3,49x10⁷±0,09x10⁷, p=0,007), яке імовірно виникає завдяки посиленню нейрогенеза і міграції клітин-попередників нейронів. Проте, відсутність кореляції цього збільшення з функціональними порушеннями, що виникають в цій експериментальній моделі, говорить про неповну інтеграцію цих нових нейронів в існуючі нейронні мережі або про дисфункцію самих нейронних мереж із-за порушення мієлінізації.

Об’ем гіпокампального регіона СА1 зростав з віком тварин незалежно від статі з 7,66x10^-10м³±0,24x10^-10м³ у 4 тижня до 7,82x10^-10м³±0,24x10^-10м³ в 8 тижнів та 8,14x10^-10м³±0,24x10^-10м³ в 20 тижнів (р=0,005), що корелювало із зростанням об’ему ядер нейронів у цьому регіоні з 276,29x10^-16м³±9,56x10^-16м³ у віці 4 тижнів до 294,50x10^-16м³±8,29x10^-16м³ в 8 тижнів та 340,50x10^-16м³±7,66x10^-16м³ у 20 тижнів (р<0,001), та з динамикою кількості клітин глії – 7,76x10⁴±0,72x10⁴ в 4 тижня, 7,98x10⁴±0,34x10⁴ в 8 тижнів та  8,54x10⁴±1,08x10⁴ в 20 тижнів (р=0.016).  Тоді як ХЕГ не впливала на об'єм гіпокампального поля СА1 і об'єм ядер гіпокампальних нейронів, виявлялося значне зниження кількості нейронів (7,43x10⁵±0,31x10⁵, 5,88x10⁵±0,57x10⁵, р=0,03) і нейроглії (7,76x10⁴±0,72x10⁴, 4,31x10⁴±0,72x10⁴, р=0,006) в цьому регіоні у самок і самців щурів у віці 4 тижнів.  Більш того, в СА1 самців щурів експериментальної групи у віці 8 і 20 тижнів була помітна підвищена експресія астрогліального маркеру ГФКБ, що говорить про астрогліоз і, таким чином, відображає великий ступінь пошкодження цієї структури у самців щурів дією ХЕГ. Імовірно, що ХЕГ має найбільш негативний вплив на олігодендроцити гіппокампу щурів. Більш того, період експериментального впливу ХЕГ у застосованій експериментальній моделі збігався з критичним періодом постнатального розвитку олігодендроцитів та міелінізації провідних путів гіппокампу щурів. Зниження ефективності виконання гіппокамп-залежних завдань по завершенню ХЕГ процедур є чітко встановленим у молодих гризунів, що говорить о кореляцію виявленого нейронального та гліального дефіциту в СА1 з функціональними порушеннями, і його ключовій ролі в ранніх когнітивних порушеннях при застосуванні ХЕГ.

 По закінченню експериментальної процедури було помітне кількісне відновлення поля СА1 з однаковою кількістю нейронів у самців експериментальної і контрольної групи у віці 8 і 20 тижнів, тоді як у самок експериментальної групи кількість нейронів перевищувала таке у самок контрольної групи у віці 8 тижнів  (7,13x10⁵±0,20x10⁵ і 8,70x10⁵±0,44x10⁵, р=0,019) і 20 тижнів (5,79x10⁵±0,37x10⁵ і 7,58x10⁵± 0,42x10⁵, р=0,019). Відомо, що гіпокамп ссавців характеризується пластичністю та здатністю до функціонального та кількісного відновлення після ішемічних, гіпоксичних та хімічних уражень. Таким чином, було встановлено, що вплив ХЕГ приводить до нейрогенезу та міграції клітин-попередників до гіпокампу, що приводить до значного відновлення його структури та функції.  Слід зазначити, що гендерні відмінності в характері морфологічного відновлення СА1 поля гіпокампу корелюють з відмінностями у функціональному відновленні по завершенню ХЕГ (L.Kheirandish et al., 2005). 

Стереологічні дані отримані в цьому досліджені свідчать, що об’ем амбігуального ядра зростав з віком експериментальних тварин з 1,71x10^-11м³±0,07x10^-11м³ у віці 4 тижнів до 2,02x10^-11м³±0,13x10^-11м³ в 8 тижнів та 2,19x10^-11м³±0,13x10^-11м³ у віці 20 тижнів (р=0,001). Об'єм ядра був значно менший у самок, ніж самців, з різницею середніх -0.17x10^-11м³ (довірчий інтервал -0,32, -0,02, р=0,026). Об’ем ядер нейронів амбігуального ядра зростав з віком з 304,43x10^-16м³±17,82x10^-16м³ у 4 тижня до 502,13x10^-16м³±12,66x10^-16м³ у 8 тижнів та 800,76x10^-16м³±27,06x10^-16м³ у 20 тижнів (р<0,001), а кількість клітин глії зростала з 8,24x10²±0,46x10² в 4 тижня до 8,70x10²±0,47x10² в 8 тижнів та 9,58x10²±0,53x10² в 20 тижнів (р=0.047). Вплив ХЕГ на розвиток амбігуального ядра був обмежений транзиторним астрогліозом і підвищенням активності ГФКБ у щурів у віці 4 і 8 тижнів, а також помірним зниженням об'єму структури, що було виявлене за допомогою дисперсійного аналізу (різниця середніх -0,18x10^-11м³ (довірчий інтервал -0,33, -0,03, р=0,017).

Об’ем ядра під'язикового нерва зростав з віком щурів з 2,29x10^-10м³± 0,07x10^-10м³ у 4 тижня до 2,17x10^-10м³± 0.11x10^-10м³ у 8 тижнів та 2,64x10^-10м³±0,12x10^-10м³ у 20 тижнів (р=0,005). Вплив ХЕГ приводив до зменшення об’ему ядра у самців щурів (різниця середніх -0.23x10^-10м³, p=0,05, довірчий інтервал -0.45, 0.00), та збільшення об’ему ядра у самок (різниця середніх 0,27x10^-10м³ (p=0,02, довірчий інтервал 0,05, 0,50).

Об’ем ядер нейронів в ядрі під'язикового нерва щурів зростав з віком незалежно від статі тварин, з 315,17x10^-16м³±8,52x10^-16м³ в 4 тижні до 547,17x10^-16м³±16,54x10^-16м³ у 8 тижнів та 937,50x10^-16м³± 32,20x10^-16м³ у 20 тижнів (р<0,001). Стереологічний аналіз впливу ХЕГ на ядро під'язикового нерва показав збільшення кількості нейронів в структурі у самок щурів (7,18x10³±0,74x10³, 8,99x10³±0,15x10³, p=0,039), а також стійке зниження об'єму ядер нейронів, що входять до складу цієї структури, помітне у всіх вікових групах і особливо – у віці 4 тижнів (315,17x10^-16м³±8,52x10^-16м³, 276,57x10^-16м³±6,63x10^-16м^3, р=0,004)  і 8 тижнів (547,17x10^-16м³±16,54x10^-16м³, 427,83x10^-16м³±19,71x10^-16м³, р=0,001). ХЕГ також призводила до стійкого зниження кількості кліток глії в ядрі під'язикового нерва, найбільш виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,54x10⁴±0,05x10⁴, 1,14x10⁴±0,15x10⁴, р=0,037) і 8 тижнів (1,71x10⁴±0,05x10⁴, 1,44x10⁴±0,07x10⁴, р=0,012). Відомо, що об'єм ядра нейрону тісно пов'язаний з деякими іншими морфологічними параметрами нейрона, включаючи розмір перикаріона, ступінь арборизації дендритів  і кількість пост-синаптичних дендритичних терміналів, що дозволяє підозрювати ХЕГ в порушенні постнатального ультраструктурного розвитку нейронів ядра під'язикового нерва. Такі нейрональні зміни у поєднанні із стійким дефіцитом кліток глії, спостережуваним в структурі, можуть пояснити функціональні порушення в контролі верхніх дихальних шляхів при ХЕГ (S.C. Veasey et al., 2004).

Аналіз отриманих результатів дослідження дозволяє зробити висновок про те, що вплив ХЕГ на розвиток чотирьох структур мозку характеризується комбінацією довготривалих деструктивних і адаптивних морфологічних змін, які можуть лежати в основі функціональних змін, як в експериментальних моделях ХЕГ, так і у дітей з ОАС.

ВИСНОВКИ

1.     Здійснені в даній дисертаційній роботи дослідження дозволили вирішити актуальну задачу патологічної анатомії – визначення морфофункціональних змін у корі, гіпокампі, ядрі під’язичного нерву та амбігуальному ядрі під впливом ХЕГ під час постнатального розвитку цих структур, що може бути експериментальними та теоретичними обгрунтуваннями профілактики розвитку неврологічної патології у дітей з ОАС. Вплив ХЕГ характеризується якісними та кількісними  морфологічними змінами та є наслідком  комбінації як деструктивних так і адаптивних процесів, що відбуваються в вивчених структурах.

2.     Застосована експериментальна модель впливу ХЕГ є апробірованою та характеризується як мінімальним порушенням сну так і значними когнитивними та поведінковими порушеннями у щурів в тестах водяного лабірінту Моріса та відкритому полі. Таким чином, спостережені морфофункціональні зміни ЦНС щурів є наслідком впливу ХЕГ, а не інших патологічних компонентів ОАС. Дані наведені у цьому дослідженні переконливо свідчать про про те, що ХЕГ, а не інші патологічні компоненти ОАС, несуть переважну відповідальність за когнитивну дисфункцію та затримку у фізичному розвитку, спостережувану у дітей з ОАС.

3.     Вивчені структури нервової системи характеризуються різною чутливістю до дії ХЕГ, а також мають різну здатність до відновлення. Більш чутливими до дії ХЕГ є гіппокамп, кора головного мозку та ядро під’язикового нерву, а менш чутливим є амбігуальне ядро. І зокрема, в СА1 полі гіппокампа у щурів віком 4 тижні відмічалося зниження кількості нейронів (7,43x10⁵±0,31x10⁵, 5,88x10⁵±0,57x10⁵, р=0,03) і нейроглії, в корі головного мозку – зниження її об'єму, особливо виражене у тварин у віці 4 тижнів (1,87x10^-7м³±0,03x10^-7м³,  1,76x10^-7м³±0,04x10^-7м³, р=0,038), а також підвищення кількості нейронів, підвищення імунореактивності ГФКБ у самців щурів і зниженням ГФКБ і кількості клітин глії у самок, а також незмінна активність nNO-синтази. В ядрі під’язикового нерву відмічалося зниження об’єму ядра, об’ему ядер нейронів, помітне у всіх вікових групах (4 тижні - 315,17x10^-16м³±8,52x10^-16м³, 276,57x10^-16м³±6,63x10^-16м³, р=0,004), зниження кількості кліток глії - (4 тижні - 1,54x10⁴±0,05x10⁴, 1,14x10⁴±0,15x10⁴, р=0,037). Відновлення СА1 мало гендер-залежний характер, з однаковою кількостю нейронів у самців у віці 8 і 20 тижнів, помітним ГФКБ-астрогліозом, та більшою ніж в контролі кількостю нейронів у самок у 8 тижнів (7,13x10⁵±0,20x10⁵ і 8,70x10⁵±0,44x10⁵, р=0,019) і 20 тижнів (5,79x10⁵±0,37x10⁵ і 7,58x10⁵± 0,42x10⁵, р=0,019). Вплив ХЕГ на розвиток амбігуального ядра був обмежений транзиторним астрогліозом і підвищенням активності ГФКБ у щурів у віці 4 і 8 тижнів, а також помірним зниженням об'єму структури.

4.      Тимчасові ХЕГ-індуковані зміни в корі головного мозку і гіпокампі у вигляді зменшеної кількості нейронів та клітин глії у полі СА1 та підвищеної експресії ГФКБ у корі головного мозку свідчать, що на ранньому етапі нейрокогнитивні порушення, притаманні цій експериментальній моделі та ОАС у дітей, виникають із-за дисфункції, в основному, гіпокампальних механізмів, тоді як на пізніших етапах вираженість і вид когнітивних порушень визначається дисфункцією кортикальных, субкортикальных механізмів та їх зв’язків.

5.     Дисперсійний аналіз впливу ХЕГ показав, що відновлення гіпокампального поля СА1 має помітний гендер-залежний характер, та характеризується гіперплазією нейронального шару цей структури, що корелює з гендер-залежним відновленням когнітивних функцій у самок, але не самців щурів. Цей феномен свідчить про можливість терапевтичного використання невідомих на даний момент механізмів морфологічного і когнітивного відновлення у самок щурів. Одним з таких механізмів може бути дисфункція гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної осі у самців щурів. Таким чином, затримка фізичного розвитку на 8 тижні після завершення дії ХЕГ, а також деяке «недосягнення» нейрогенного потенціалу ХЕГ шляхом зниження нейрогенеза та/або виживання нових нейронів у гіппокампі самців щурів вказує на потенціальну роль ХЕГ у довготривалій дисфункції гіпоталамо-гіпофізарно-гонадної осі у самців щурів у формі гіпогонадизму.  Морфологічні дані, що стосуються впливу ХЕГ на розвиток гіппокампу щурів, є підтвердженням гіпотези про більш значний ушкоджувальний вплив ХЕГ на самців, ніж самок щурів. Цей факт може бути пов’язаний з підвищеною захворюванністю подібним до синдрому дефіциту уваги і гіперактивності хлопчиків з ОАС.

6.      Чутливість нейронів ядра під'язикового нерва до ХЕГ, з тривалим зниженням об’ему ядер нейронів у ядрі під’язикового нерву, виявлена в даному дослідженні, підтримує гіпотезу про важливу роль ХЕГ в хронізації ОАС, завдяки індукції морфофункціональних порушень в центральних механізмах контролю верхніх дихальних шляхів. Крім того, значна чутливість до впливу ХЕГ ядра під'язикового нерву та відсутність помітних змін у амбігуальному ядрі свідчить про більш значну роль дисфункції контролю м'язів язика, ніж контролю м'язів задньої стінки глотки при хронізації апное. Довготривалий характер морфофункціональних порушень в ядрі під’язикового нерву свідчить про те, що зміни в контролі верхніх дихальних шляхів при ХЕГ можуть бути необоротними, таким чином указуючи на необхідність ранньої діагностики і лікування ОАС у дітей. Ці морфофункціональні порушення можуть бути відповідальні за рецидив ОАС у пацієнтів, що були проліковані, при виникненні в них додаткових факторів ризику.

Практичні рекомендації. Дане дослідження вказує на значний і довготривалий характер порушень в морфофункціональному розвитку структур ЦНС під впливом ХЕГ. Таким чином, ця робота узгоджуються як з експериментальними даними, що вказують на короткочасні і довготривалі когнітивні порушення у тварин під впливом  ХЕГ, так і з епідеміологічними дослідженнями, що свідчать про негативні наслідки ОАС у дітей, зокрема – понижену успішність в школі і підвищений ризик розвитку синдрому дефіциту уваги і гіперактивності. Довготривалі морфофункціональні порушення у ядрі під’язичного нерву під впливом ХЕГ вказують на можливість хронічних порушень в контролі верхніх дихальних шляхів. Це спостереження корелює з клінічними даними про значно підвищенний рівень захворюваності ОАС у людей, що мали ОАС у дитинстві та були проліковані. Таким чином, на підставі спостережень даного дослідження сімейним лікарям, педіатрам і отолярингологам пропонується звертати додаткову увагу на дітей з симптомами порушення дихання під час сну, а також проводити навчання їх батьків на предмет раннього виявлення зміни характеру дихання у дітей під час сну, та порушень фізичного і когнітивного розвитку, з метою попередження наслідків ОАС, а лікарям-терапевтам рекомендується проводити цільове обстеження пациентів з сердцево-судинними захворюваннями та гіперсомнією для виявлення ОАС.

Значне порушення морфофункціонального розвитку структур ЦНС під впливом ХЕГ вказує на можливість використання стереологічної оцінки морфофункціональних параметрів цих структур, і зокрема визначення загальної кількості нейронів у пірамідальному шарі СА1 поля гіпокампа і імунореактивності ГФКБ, як можливий альтернативний метод патологоанатомічної діагностики патології раннього постнатального періоду, зв’язаної з пливом ХЕГ.