ПРОФІЛАКТИКА ПОСТМАСТЕКТОМІЧНОГО СИНДРОМУ ШЛЯХОМ ЗАСТОСУВАННЯ РОСЛИННИХ ФЛАВОНОІДІВ (експериментально-клінічне дослідження)

summary

Матеріали та методи дослідження. Були обстежені 188 пацієнток, що пройшли радикальне лікування з приводу РГЗ у Вінницькому обласному клінічному  онкологічному диспансері з 1996 по 2002 роки. Контрольну групу склали 105 хворих, які обстежувалися в різні терміни після операції (через 1, 3 і 5 років). Клінічну – 83 хворих, які, окрім стандартного радикального лікування РГЗ, отримували детралекс в дозі по 500 млг 2 рази на день, впродовж 15 днів після операції і спостерігалися нами протягом 3 років після закінчення радикального лікування. У всіх 188 хворих виконана радикальна мастектомія (РМЕ) по одній з класичних методик. Найчастіше в контрольній групі проводилася РМЕ за Пейті (63,8%±4,7%) і за Мадденом (33,3%±4,6%). Усім хворим клінічної групи була проведена РМЕ за Мадденом. Радикальна мастектомія за Холстедом виконана всього 3 хворим контрольної групи з місцево-розповсюдженим раком III стадії (2,9%±1,6%).

ТГТ проведена у 101 випадку (96,2%±1,9%) у хворих контрольної групи і у 80 хворих (96,3%±2,0%) клінічної групи. Хворим з I-II стадіями виконувалася променева терапія за інтенсивною програмою (СОД 20-25 Гр), у 24 жінок (22,9%±4,1%) контрольної і у 10 пацієнток (12,1%±3,6%) клінічної групи. Дрібно-протяжна ТГТ дрібними фракціями (СОД 45-60 Гр) була проведена 31 хворій (29,5%±4,5%) контрольної і 23 хворим (27,7%±4,9%) клінічної групи. У 46 хворих (43,8%±4,8%) контрольної групи і у 47 хворих (56,6%±5,4%) клінічної проводилася ТГТ до і після операції. Статистично значущої відмінності розподілу частоти окремих видів ТГТ між контрольною і клінічною групами не виявлено (за критерієм  p=0,20).

Хворі обох груп істотно не відрізнялися, що дозволяє вважати дослідження рандомізованим. Незначні вікові відмінності не вплинули на вірогідність отриманих результатів.

Для діагностики постмастектомічного синдрому використовувались наступні методи.

Клінічно оцінювався біль у кінцівці з боку операції, його інтенсивність, залежність від фізичного навантаження та об'єму рухів. Порушення чутливості шкіри визначали за суб'єктивними відчуттями хворих (парестезією та анестезією) при поколюванні і шляхом визначення тактильної чутливості. Порушення рухів у плечовому суглобі вивчали шляхом вимірювання об'єму рухів у фронтальній і сагітальній площинах. Набряк верхньої кінцівки визначали шляхом вимірювання периметра плеча на рівні середньої третини порівняно із здоровим боком. Різницю визначали в см. І ст. – різниця периметра плеча з боку операції та зі здорового боку до 2 см; ІІ ст. – 2-4 см; ІІІ ст. – різниця периметра більше 4 см (Пронін В.М., 1985; Дрижак В.І. та ін., 1998). Для вимірювання м'язової сили кисті використовувалась динамометрія.

Методом ультразвукової денситометрії обстежено 65 хворих на РГЗ в різний термін (через 1, 3, 5 років) після радикального комбінованого лікування. Використовувалися: ультразвукова діагностична система CAPASEE модель SSA-220A (Toshiba, Japan); лінійний датчик модель PVG-720S, робоча частота 7,5 Мгц; параметри настройки сканера були постійними (Gain-74, IP-4); вимірювання на ділянці тканини обмеженого кола з діаметром близько 10мм (кількість піксилів не менше 1000). Ехографічна щільність вимірювалася в дБ.

Оцінка ступеня зниження функціональної здатності тканин з боку операції проводилась шляхом порівняльної денситометрії грудних м'язів з обох боків.

Морфологічне дослідження структури грудних м'язів проводили шляхом трепан-біопсії великого грудного м'яза зі здорового боку і з боку операції. Парафінові зрізи фарбували гематоксилін-еозином та за методом Ван Гізона і досліджувалися за допомогою світлового мікроскопа МБІ-11 (Росія).

Досліди проведені на 120 щурах, самцях популяції Вістар, вагою 80 – 120 г. Під час дослідів тварини знаходилися на напівсинтетичному раціоні, що забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів (Островский Ю.М., 1979). 

Тварини були розділені на чотири групи: А – здорові щури (n=30) - контрольна група 1; B – здорові щури, що отримували детралекс у дозі 140 мг/кг у день (n=30) - контрольна група 2; С – щури, яким опромінювався м'язовий масив задньої правої лапи в дозі, еквівалентній 45 Гр (n=30); D – щури, яким опромінювався м'язовий масив задньої правої лапи в дозі, еквівалентній 45 Гр (n=30), і які отримували детралекс в дозі 140 мг/кг за добу. Детралекс уводився через шлунковий зонд впродовж 15 днів.

Опромінювання проводилося на гамма-терапевтичному дистанційному апараті “АГАТ-Р” (активність джерела 4330 Кюрі).

Морфологічне дослідження м'язів і біохімічні дослідження сироватки крові та гомогенату м'язової тканини проводилося через 1 місяць після опромінення (експер. 1) і через 3 місяці (експер. 2). З експерименту щури виводилися під легким ефірним наркозом.

Біохімічні дослідження крові і гомогенату опроміненого і неопроміненого м'яза проводилися у два етапи: через місяць після опромінення (у 10 тварин групи С і 9 – групи D) і через три місяці від початку експерименту (у 16 щурів групи С і у 14 – групи D).

Гомогенат м'язів отримували ретельною гомогенізацією (тефлон-скло, 3000 об/хв.). Карбонільні групи білків визначали відомим методом (Levine RL. et al., 1994). До аліквоти гомогенату додавали розчин 2,4-динітрофенілгідразину на соляній кислоті й інкубували 20 хв. Білок гомогенату тричі осаджували 5% трихлороцетною кислотою і після додавання 1 мл 5% розчину гідроксиду натрію, визначали оптичну густину при 490 нм.

Вміст в гомогенаті м'язів малонового діальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою з наступною екстракцією одержаного хромогену в бутанол (Mihara M., Uchiyama M., 1978).

Загальний білок визначали за відомим методом (Остапець М.Г., Романська Н.М., 1974). У мінералізаті визначали амонійний азот з реактивом Неслера. Саркоплазматичні білки екстрагувалися з м'язів дистильованою водою, а міофібрилярні білки екстрагувалися 10% розчином хлориду амонію; кількісне визначення цих білків вели біуретовим методом.

Ліпідний склад гомогенату м'язів визначали після екстракції ліпідів за методом Bligh, Dyer (Кейтс М., 1975). Загальний вміст ліпідів визначали за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом, а загальних фосфоліпідів – екстракційно-фотометричним методом (Пентюк О.О. та ін., 1987). Ліпідний спектр визначали методом тонкошарової хроматографії на силікагелі Л5/40 (Chemapol,Чехія). Нейтральні ліпіди розділяли в системі гексан-дієтилова ефір-мурашина кислота у співвідношенні 16:4:0,2 (за об'ємом) фосфоліпіди – в системі хлороформ-метанол-вода у співвідношенні 65:30:5 (за об'ємом) (Кейтс М., 1975). Ідентифікацію індивідуальних нейтральних ліпідів і фосфоліпідів після їх хроматографічного розділення проводили методом свідків і за допомогою якісних реакцій на холін, етаноламін, серин, сфінгомієлін і за величинами Rf, відомими з літератури (Кейтс М., 1975). Кількісне визначення фракцій ліпідів після їх хроматографії проводили за реакцією з фосфорнованіліновим реактивом.

Вміст колагену оцінювався за кількістю оксипроліну, з використанням методичних підходів, описаних раніше (Кузнецова Т.П. та ін., 1982; Siddiqi N.J. et al., 2003). Для визначення вільного і пептидозв’язаного оксипроліну до аліквоти гомогенату додавали охолоджений до 4⁰ етанол і витримували в холодильнику 15хв., після чого центрифугували при 3000 об/хв. 15 хв. Супернатант містить вільний і пептиднозв’язаний оксипролін, а осад – білковозв’язаний оксипролін. Вільний оксипролін визначали безпосередньо в цьому супернатанті, а для визначення пептиднозв’язаного оксипроліну супернатант піддавали гідролізу у присутності 8 М перхлоратової кислоти при кип'ятінні впродовж 4 годин. Білковозв’язаний оксипролін визначали в білковому осаді, який піддавали гідролізу на киплячій водяній бані у присутності 8 М перхлоратової кислоти впродовж 6 годин. Кількісне визначення оксипроліну вели за методом Bergman І., Loxley R., використовуючи за окислювач хлорамін Т (Bergman І., Loxley R., 1970). Кількість колагену розраховували, виходячи з того, що він містить 12,5% оксипроліну – коефіцієнт 8.

Гістологічне дослідження проводилося у два етапи через місяць і через три місяці (по 20 тварин з кожної групи) від початку експерименту. Досліджувалася м'язова тканина опроміненої кінцівки, за контроль служила м'язова тканина неопромінених тварин. Забарвлення парафіновиих зрізів здійснювалося гематоксилін-еозином і за Ван Гізоном, огляд мікропрепаратів проводився під світловим мікроскопом МБІ-11.

При проведенні статистичного аналізу результатів дослідження розраховувалося значення середнього арифметичного і помилка середнього (±m). Для представлення якісних характеристик використовувався показник частоти прояву ознаки (%) і вказувалась помилка частки (%). При оцінці істинного середнього значення показника використовувався розрахунок 95% вірогідного інтервалу (ВІ), який дозволяє оцінити, в яких межах може знаходитися істинне значення параметра в популяції на рівні значущості p=0,05.

Для порівняння середніх показників вибірок до і після дії застосовувався критерій Стьюдента для зв'язаних вибірок (у разі нормального закону розподілу), або T-критерій Вілкоксона (у разі відмінності закону розподілу від нормального). Відмінність вважалася статистично значущою при рівні значущості р<0,05. При порівнянні більше двох вибірок між собою використовувалися методи множинних порівнянь: дисперсійний аналіз і метод множинних порівнянь Шеффе, у разі нормального закону розподілу або критерій Круськала–Уолліса і критерій Данна, у разі відмінності закону розподілу від нормального. При порівнянні частоти прояву якісних ознак використовувався критерій . Для оцінки ефективності використовувався показник відносного ризику (ВР). У клінічних дослідженнях це відношення частоти певного результату в експериментальній групі до частоти таких же результатів в контрольній групі. Для виявлення зв'язку між ознаками застосовувалися методи кореляційного аналізу: розраховувався коефіцієнт кореляції Пірсона r (у разі нормального закону розподілу) або показник рангової кореляції Спірмена с (у разі відмінностей закону розподілу від нормального).      

Основні результати дослідження. На першому етапі дослідження проаналізували основні ускладнення радикального лікування РГЗ, серед яких превалювали порушення чутливості шкіри в зоні операції, обмеження рухливості у плечовому суглобі, зниження м’язової сили, набряк і біль руки з боку операції. Було показано, що ступінь постмастектомічних ускладнень прямо залежить від інтенсивності і тривалості ТГТ і найбільш виражений у пацієнток, які отримували ТГТ до і після операції.

Більшість ускладнень розвивалося в перші місяці після лікування і практично не змінювалися через 1 рік, 3 роки і 5 років.

За допомогою трепан-біопсії проводили гістологічне дослідження великого грудного м'яза з боку операції і виявляли зміни його морфологічної структури. У пацієнток без проявів ПМЕС в мікропрепаратах м'яза чітко визначаються його паренхіма і строма, м'язові волокна однотипні, нормально структуровані.

Морфологічні зміни, що спостерігались у хворих з ПМЕС, можна умовно розділити на три групи:

Незначні – у вигляді утворення альвеолярних порожнин, незначної атрофії і дегенерації м'язових волокон, що зустрічалися у хворих, які отримували ТГТ за  інтенсивною програмою і мали помірні прояви ПМЕС.

Помірні – при яких виявляються осередки розкомплектації внаслідок лімфостазу, ділянки грубої контрактурної дегенерації в дистрофічно змінених м'язових волокнах, воскоподібний некроз. Ці прояви відповідали ПМЕС середнього ступеня вираження і спостерігалися у пацієнток, в основній масі, отримуючих ТГТ за дрібно-протяжною програмою.

Значні – у вигляді міофіброзу, склерозу, воскоподібного некрозу м'язів, вираженого пери- та ендоваскуліту, що призводять до облітерації судин. Усі ці явища визначалися у хворих з тяжкими проявами ПМЕС, значним лімфостазом, контрактурами та іншими симптомами. Переважна більшість цих хворих одержала ТГТ до і після операції.

Таким чином встановлено, що вираженість ПМЕС безпосередньо залежить від дегенеративних змін у м'язовій тканині, які призводять до порушення мікроциркуляції і лімфовідтікання. Найбільшою мірою ПМЕС проявляється при розвитку в грудних м'язах міосклерозу і міофіброзу, які залежать від променевих пошкоджень у більшій мірі, ніж від травматичності операції і найбільш виражені при проведенні ТГТ до і після операції.

Для діагностики ПМЕС на ранніх стадіях ми використали ехографічну денситометрію, яка дає змогу визначення щільності тканин без трепан-біопсії. При порівнянні показників денситометрії з боку операції і зі здорового боку простежується збільшення щільності тканин з боку операції, яке прямо залежало від програми ТГТ. Особливо помітні відмінності при проведенні ТГТ до і після операції.

Показники ехографічної щільності прямо корелювали з проявами ПМЕС. Найчутливішим показником виявилася різниця у щільності грудних м'язів на здоровому боці і з боку операції, яка прямо корелювала зі зниженням м'язової сили кисті (r=0,86), набряком кінцівки (r=0,79), обмеженням рухливості кінцівки (r=0,76), болями в руці (r=0,73). Ступінь морфологічних змін у м'язах відповідав зростанню їх ехографічної щільності.

Постпроменеві зміни у м'язовій тканині носять виражений і стійкий характер, що підтверджується практично однаковими показниками денситометрії грудних м'язів з боку операції через 1, 3 і 5 років після лікування.