СТРУКТУРНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ РАКА ЖЕЛУДКА: ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА : СТРУКТУРНА ГЕТЕРОГЕННІСТЬ РАКУ ШЛУНКА: ФАКТОРИ ПРОГНОЗУ

summary

Матеріал та методи дослідження. Досліджено 263 випадки раку шлунка на операційному та секційному матеріалі, з них 89 (33,8%) випадків кишкового типу, 129 (49,1%) випадків дифузного та 45 (17,1%) випадків змішаного або некласифікованого типу.

Частота випадків з інвазією судин та метастазами незначно відрізнялась у дифузному та змішаному типі раку шлунка: відповідно з інвазією – 66 випадків (51,1%) та 20 (44,4%) випадків, однак різко відрізнялась від кишкового типу раку шлунка: з інвазією у 22 випадках (24,7%). Залежно від наявності пухлинних емболів у судинах ми оцінювали інвазивний потенціал пухлини, виходячи з роботи T. Mita, T. Shimoda (2001), відповідно до якої інвазія пухлиною лімфатичних судин у випадках раку шлунка була найзначнішою детермінантою (OR 8,68) для метастазів у лімфатичні вузли, які різко погіршують прогноз.

Уражені раком шлунки описувались макроскопічно, а далі виконували гістотопографічне дослідження пухлини. Для цього вирізувались та нумерувались шматочки пухлини, які фіксували у 10% и 4%-ному розчині формаліну, рідинах Карнуа та Севки, нефіксовані шматочки швидко заморожувалися для приготування кріостатних зрізів.

З фіксованого матеріалу виготовлялись парафінові блоки. Зрізи фарбувалися гематоксиліном та еозином. Для виявлення колагенових волокон використовували фарбування пікрофуксином за ван-Гізоном. Для підрахунку кількості мітозів використовували виявлення нуклеїнових кислот шляхом фарбування галоціаніном та хромовими квасцями, кількість мітозів підраховувалась як середнє число мітотичних фігур у полі зору під великим збільшенням (х400) з 10 послідовно взятих полів зору.

У кріостатних зрізах методом сполучення виявлялась активність неспецифічної естерази, лужної фосфатази, активність пероксидази у лейкоцитах виявлялася діамінобензидіном, неспецифічної естерази, яка характерна для апудоцитів, а також для кишкового епітелію.

У оцінці виразності гетерогенності пухлини на тканинному рівні виходили з класифікації P. Lauren. Для кишкового типу раку шлунка характерна високодиференційована аденокарцинома, яка складається з великих залоз з рівним апікальним краєм клітин, чітким широким отвором. Помірнодиференційована аденокарцинома характеризувалась дрібними залозами, частіше близько розташованими  одна від одної, з вузькими отворами. До низькодиференційованих аденокарцином віднесені ділянки з дрібними залозами та залозисто-подібними структурами майже без отворів, кріброзними, солідними структурами. Рак шлунка дифузного типу характеризувався  різким зниженням або відсутністю зв’язків пухлинних клітин – вони відокремленні одна від однієї, або формували дрібні групи, тобто характеризувались низькою тканиною диференціацією. До змішаного типу раку шлунка віднесені пухлини, де мало місце поєднання ділянок кишкового типу раку шлунка та дифузного, або пухлина мала будову солідного раку. Наявність в пухлині одного ступеня диференціювання на тканинному рівні оцінювалась як слабка гетерогенність, двох – як помірна, трьох – як висока гетерогенність.

Ґрунтуючись на виразність клітинного атипізму, виділені три основних типу пухлинних клітин. Клітини з дрібними мономорфними гіперхромними ядрами та значною кількістю цитоплазми розцінювались, як клітини  зі слабким клітинним атипізмом (високим клітинним диференціюванням).  Клітини з помірно виразним атипізмом характеризувалися крупними світлими з ядерцями або помірно гіперхромними ядрами з помірною кількістю цитоплазми.  Пухлинні клітини з різко поліморфними гіперхромними ядрами та малою кількістю цитоплазми віднесені до різко атипових клітин. Наявність одного типу клітин у пухлині розцінювалась як слабка гетерогенність, двох типів клітин – як помірна гетерогенність, усіх трьох типів клітин – як висока гетерогенність на клітинному рівні.

Ступінь виразності функціонального диференціювання оцінювалась на основі виразності секреції муцину та ендокринного диференціювання пухлинних клітин. Для виявлення секреції муцину препарати фарбувалися альціановим синім при рН=2,6 та 1,0, ставилася ШИК-реакція.

Для виявлення ендокринного диференціювання використовувались методи імпрегнації сріблом за методом Гримеліуса та Масона, фарбування за методом Севкі, яке виявляє біогенні аміни. У певному числі випадків було застосовано імуногістохімічне дослідження з моноклональними антитілами до нейронспецифічної енолази (NSE), гастрину.

В основу класифікації ступеня виразності ендокринного диференціювання  (ЕКД), були покладені критерії E. Tahara (1988), І.К. Дерижанової (1991). 

Були виділені ендокриноклітинні раки (ЕКР), коли від 50% до 100% пухлинних клітин мали ендокринні гранули та ці клітини були рівномірно розподілені у пухлині. Вони у свою чергу розподілялись на високо-, помірно- та низькодиференційовані ЕКР залежно від кількості ендокринних гранул у цитоплазмі пухлинних клітин.

Крім того, виділена група пухлин з невеликою кількістю клітин з ЕКД від половини до поодиноких, але які рівномірно розподілялись у всій пухлині, а також групи з ділянковою ЕКД та без ЕКД.

            Для виявлення глюкоконьюгатів ми застосували панелі з 8 лектинів, мічених пероксидазою. Застосовувались такі лектини:  лектин зав’язі пшениці (WGA), специфічний до глюкозаміну та сіалових кислот; лектин арахісу (PNA), специфічний до D-галактози, галактозаміну; лектин виноградного равлика (HPA), специфічний до галактозаміну та глюкозаміну; лектин сої (SBA), специфічний до D-галактози, галактозаміну; лектин бузини чорної (SNA), специфічний до сіалових кислот та галактозаміну; лектин золотого дощу (LAL), специфічний до L-фукози; лектин омели (VAL), специфічний до галактози; лектин сочевиці (LCA), специфічний до маннози, глюкози, глюкозаміну.

Імуногістохімічно для дослідження експресії цитокератинів використовували мишачі моноклональні антитіла АЕ1\АЕ3 та МNF-116. Для визначення проліферативної активності застосовувався Ki-67, виявлялася експресія білка р53. Для оцінки особливостей паренхіми застосовувались моноклональні антитіла до виментину.

Гістологічні препарати були досліджені під світлооптичним мікроскопом Olympus ВХ-40, мікрофотографування проводилось цифровою фотокамерою Olympus U-TV1X з програмним забезпеченням Olympus DP-Soft.

Статистична обробка отриманих результатів досліджень виконана на персональному комп’ютері у пакеті MedStat з застосуванням базових методів математичної статистики. Статистичний аналіз показників, одержаних за результатами обробки стабілограм, виявив, що їх розподіл  відрізняється від нормального (на рівні р<0,001), залежно до чого, при  проведенні подальшого статистичного аналізу, використовувались непараметричні критерії.  Виявлялась достовірність зв’язку або різниця показників (р), для оцінки ступеня та достовірності зв’язку двох пов’язаних вибірок застосовувався коефіцієнт нелінійної кореляції Кендалла  (Tau) та коефіцієнт рангової кореляції Спірмена (Ro). Порівняння тенденцій двох незалежних виборок (порівнювались ступені різних рівнів гетерогенності між собою в залежності від наявності або вудсутності інвазії пухлинних кліток у судини) проводилась із застосуванням W-критерію Вілкоксона.

Результати дослідження та їх обговорення.    Рак шлунка за клініко-морфологічними особливостями є неоднорідним. Основні гістологічні типи його – рак кишкового, дифузного та змішаного типу – відрізняються один від одного й за даними літератури, й на нашому матеріалі. У нашому матеріалі, серед усіх раків шлунка, рак кишкового типу зустрічався у 89 випадках, або 33,8%, у раку кишкового типу декілька частіше зустрічався ранній рак (12,4%), чим серед раку дифузного типу (7,8%) и раку змішаного типу (2,6%).

Одночасно у нашому дослідженні встановлено, що у раку шлунка кишкового типу значно менше у гістологічних препаратах зустрічалася інвазія судин пухлинними клітинами (24,7%), ніж у раку шлунка дифузного (51,2%) та змішаного (44,4%) типів.

Нами виділено критерії оцінки гетерогенності раку шлунка на тканинному та клітинному рівні, а також за функціональною активністю пухлинних клітин на слабку, помірну та виразну. У всіх типах раку шлунка найчастіше зустрічалася помірно виразна гетерогенність пухлин, значно менше гетерогенність була слабкою та виразною, коливання частоти її, залежно від рівня оцінки, були незначними. Так на тканинному рівні слабка гетерогенність спостерігалася у 81 випадку (30,8%), помірна – у 123 випадках (46,8%), виразна – у 59 випадках (22,4%). На клітинному рівні слабка гетерогенність спостерігалась у 84 (31,9%), помірна – у 143 випадках (55,4%), виразна – у 36 випадках (13,7%). Функціональна гетерогенність пухлинних кліток була слабкою у 76 випадках (28,8%), помірна – у 146 випадках (55,5%), виразна – у 41 випадку (15,6%).

Така тенденція виразності гетерогенності очевидно зумовлена характером матеріалу: в основному це були просунуті, тобто з інвазією всіх слоїв стінки шлунка, раки, але у більшості все ж видалені оперативно, приблизно на одному рівні прогресії.

Однак ступінь гетерогенності в різних типах раку шлунка (у кишковому, дифузному та змішаному) відрізнялась залежно від рівня її – на тканинному, клітинному та функціональному.

На тканинному рівні гетерогенність у разі дифузного раку шлунка виявлялася практично з однією частотою – слабкою (48%) та помірною (49,6%), це був недиференційований рак з розсипним типом росту, відокремленістю клітин одна від одної (слабка гетерогенність), або поряд з таким ростом зустрічалися ділянки низькодиференційованої аденокарциноми, тяжи клітин, групки клітин, тобто була тенденція до поєднанням клітин між собою.  Дуже рідко (2,4%) зустрічалась  виразна гетерогенність, коли були знайдені дрібні зони, інколи поодинокі залози помірно – або високодиференційованої аденокарциноми. 

 У випадках раку кишкового типу частота гетерогенності на тканинному рівні значно зростала від слабкої (21,3%), коли пухлина мала будову високо- та помірнодиференційованої  аденокарциноми, до помірної (38,2%), коли у пухлині з’являлися ділянки низькодиференційованої аденокарциноми, але все ж таки зберігався зв’язок пухлин між собою, незначно, в порівнянні з помірною, зростала частота високої гетерогенності (40,5%), коли з’являлися дрібні групи пухлинних кліток та відокремлені клітини, були порушені зв’язки клітин між собою.    

У випадках змішаного типу рака шлунка на тканинному рівні не було випадків зі слабкою гетерогенністю, що визначається з самого характеру пухлини, коли присутні структури, які характерні й для кишкового, й для дифузного типу рака, або проміжного (типу солідного) раку. Гетерогенність була в основному помірною (55,6%) та виразною (44,4%). 

Була порівняна частота інвазії судин у пухлині при різному ступеню гетерогенності її на тканинному рівні в основних типах раку шлунка. Рак шлунка дифузного типу визначався високою частотою інвазії судин, але вона незначно збільшувалась від слабкої (48,4%) до помірної (53,1%) гетерогенності на тканинному рівні. Частота високої гетерогенності у цього раку була незвичайно мала (2,4%), але в цій групі значно зростала інвазивність (66,7%).

У випадках раку шлунка кишкового типу інвазія судин незначно збільшувалась від слабкої (15,8%) до помірної (17,6%) гетерогенності, але різко зростала, практично вдвічі, у групі з виразною гетерогенністю (36,1%) в порівнянні з помірною.

У випадках раку змішаного типу частота інвазії судин мало змінюється від помірної (40%) до виразної (44,4%) гетерогенності на тканинному рівні.

Гетерогенність на клітинному рівні у разі дифузного раку шлунка найчастіше була помірною (60,5%), тобто виявлялися два типи клітин з низьким та помірним атипізмом, значно рідше зустрічалась слабка гетерогенність (22,5%) та виразна (17%), коли з’являлись різко атипові пухлинні клітини. При цьому частота інвазії судин незначно зростала при переході від слабкої гетерогенності (37,9%) до помірної (46%). Різко, практично вдвічі, зростала частота інвазії судин у пухлинах з виразною гетерогенністю клітинного складу (81,8%).

У випадках кишкового типу раку шлунка переважала слабка гетерогенність пухлинних клітин (53,9%), ці випадки характеризувалися низькою частотою інвазії судин (20,8%). З високою частотою (40,5%) зустрічалась також помірна гетерогенність клітинного складу цього типу раку шлунка, коли одночасно були клітини з високим та помірним атипізмом (24 випадки) або значно рідше випадки зі слабким та помірним атипізмом (12 випадків). У цій групі частота інвазії судин була дещо вищою й становила 33,3%. Випадків з високою гетерогенністю клітин було мало, усього 5 (5,6%)  у них не було інвазії судин.

У разі раку змішаного типу, як у дифузному, частіше усього зустрічались випадки з помірною гетерогенність клітин (64,4%), значно рідше з низькою (15,6%) та високою (20%) клітинною гетерогенністю. Також, як і при дифузному ракові, частота інвазії судин помірно зростала від слабкої гетерогенності (28,6%) до помірної (37,9%), й різко, більш ніж у два рази, при виразній гетерогенності (77,8%) в порівнянні з помірною.

У нашому матеріалі у випадках дифузного раку шлунка, частіше в глибоких шарах його, виявлялися пухлинні клітини, які зберегли експресію цитокератинів, секрецію муцину, продукцію нейроендокринних гранул, але вони мали продовгувату фібробластоподібну форму. Іноді виявлялася експресія виментину у них й у перснеподібних клітинах, що є прямим доказом епітеліально-мезенхімальної трансформації.       

Функціональна гетерогенність пухлинних кліток різних типів раку шлунка найчастіше була помірно вираженою. Тільки у випадках раку шлунка кишкового типу слабка гетерогенність функціональної активності пухлинних клітин за частотою наближалася до помірної  (47,2% та 48,3%). У разі дифузного та змішаного типів раку шлунка слабка функціональна гетерогенність пухлинних клітин зустрічалася приблизно однаково (19,4% та 20%). Виразна гетерогенність функціональної активності пухлинних клітин значно частіше зустрічалася у випадках дифузного типу раку (24%), ніж у випадках змішаного типу (13,3%) й мінімальною була її частота у разі раку кишкового типу (4,5%).

Це зумовлено тим, що у разі дифузного раку шлунка пухлинні клітини частіше продукують значну кількість муцину, характеризуються виразним ендокринним диференціюванням, але по мірі прогресії та зростання клітинного атипізму функціональна активність пухлинних клітин знижується, тоді у пухлині виявляються значні коливання її. У раках кишкового типу функціональна активність пухлинних клітин слабка, або підвищується до помірної й дуже рідко бува високою у слизових раках. У раку змішаного типу є розбіжності поєднання такої виразності секреції пухлинними клітинами.

 Ступінь функціональної активності пухлинних клітин може впливати на інвазивність пухлини. Було з’ясовано, що у раках шлунка з високою продукцією муцину (слизових) частіше зустрічається глибока інвазія та метастази у лімфатичні вузли (K. Yasuda et al., 2001). Імовірно частково з цим пов’язаний й більш високий рівень частоти інвазії судин у випадках дифузного типу раку в порівнянні з кишковим. У дифузному раку шлунка частіше зустрічається й більш виразне й ендокринне диференціювання клітин.

Інвазія судин у раку шлунка залежить не тільки від кількості муцину, який синтезується пухлинними клітинами, але й від якісного складу його. Лектинна гістохімія дозволила виявити окремі вуглеводні специфічності й порівняти зв’язування лектинів у групах з інвазією судин і без неї. У всіх гістологічних типах раку шлунка частіше зустрічається інвазія судин при зв’язуванні клітин з фукозоспецифічним  лектином золотого дощу (LAL).

У раку шлунка кишкового типу частіше інвазія судин спостерігалась також за наявності у пухлинних клітинах рецепторів до галактозо- та галактозамінспецифічних лектинів арахісу (PNA) та сої (SBA). У дифузному типі раку шлунка зв’язок з інвазією судин спостерігається у разі високого та помірного вмісту в пухлинних клітинах рецепторів до лектину виноградного равлика (НРА – галактозамін та глюкозамінспецифічний) та лектину бузини чорної (SNA – специфічної до сіалової кислоти).

Підводячи підсумки  дослідження слід зазначити, що рак шлунка відрізняється високою частотою гетерогенності, яка виявляється морфологічними методами дослідження, як на тканинному, так й на клітинному рівні, включаючи функціональну активність пухлинних клітин, а також імуногістохімічні особливості їх. Від ступеня виразності різних типів гетерогенності у різних типах раку шлунка залежить інвазивний потенціал пухлини, її прогноз. Гістотопографічний метод дослідження, який дає змогу прослідкувати зміни морфології пухлини по мірі росту її від слизової оболонки до більш глибоких шарів стінки шлунка й від центру до латерального краю інвазії, дав змогу з’ясувати, що у більшості випадків гетерогенність пухлини пов’язана з її прогресією, інколи (у 17 випадках раку шлунка кишкового типу) різними шляхами канцерогенезу.

ВИСНОВКИ

У дисертації дано теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, яка полягає у визначенні критеріїв ступеня виразності гістологічної та цитологічної гетерогенності раку шлунка, її частоти у основних типах його та визначення закономірностей зв’язку ступеня виразності гетерогенності з частотою інвазії пухлиною судин.

1. У всіх випадках раку шлунка має місце гетерогенність тканинної та клітинної структури його, функціональної активності пухлинних клітин різного ступеня виразності.

Гетерогенність раку шлунка на тканинному рівні була слабкою у 30,8%, помірною – у 69,2% та високою – у 22,4% випадків. На клітинному рівні слабка гетерогенність зустрічається у 31,9%, помірна – 54,4% та висока – у 13,7%. Функціональна активність пухлинних клітин була слабо гетерогенною у 28,9%, помірною – у 55,5% та високою – у 13,7% випадків.

2. Виявлена залежність ступеня виразності різних видів гетерогенності від гістологічного типу раку шлунка.

У випадках раку шлунка кишкового типу висока гетерогенність частіше зустрічається на тканинному рівні (40,5%), висока клітинна та функціональна гетерогенність зустрічається рідко (5,6% та 4,5%) й навпаки слабко виражена гетерогенність частіше зустрічається на клітинному (53,9%) та функціональному рівні (47,2%) та рідко на тканинному (21,3%).

3. У раку шлунка дифузного типу на тканинному рівні частіше зустрічається слабка (48%) та помірна (49,6%) гетерогенність і дуже рідко висока (2,4%), клітинна та функціональна гетерогенність частіше була помірною (60,5% та 56,6%), рідко слабка (22,5% та 19,4%) та висока (17% та 24%).

4. Змішаний тип раку шлунка характеризується тим, що на тканинному рівні не зустрічається слабо виразна гетерогенність, вона була помірною (55,6%) та високою (44,4%), клітинна та функціональна гетерогенність була частіше помірною (64,4% та 66,7%), рідко слабкою (15,6 % та 20%) та високою (20% та 13,3%).

5. Існує залежність частоти інвазії судин від ступеня  гетерогенності у різних типах раку шлунка.

У випадках раку шлунка кишкового типу частота інвазії судин  була низькою при  слабкій (15,8%) та помірній (17,6%) тканинній гетерогенності та різко (вдвічі) збільшувалася при високій тканинній гетерогенності (36,1%). Чіткої залежності частоти інвазії судин від клітинної гетерогенності немає, вона  незначно збільшується  від слабкої до помірної гетерогенності та відсутня при високій. Частота інвазії судин значно збільшується при високій функціональній гетерогенності в порівнянні з помірною.

6. У раку шлунка дифузного типу  нема чіткої залежності  частоти інвазії судин  від ступеня  гетерогенності на тканинному рівні. Частота інвазії залежить від ступеня клітинної та функціональної гетерогенності, вона різко збільшується при високій (до 81,8% та 67,7%) в порівнянні з помірною (46% та 45,2%).

7. Відсутня залежність частоти інвазії судин від ступеня виразності гетерогенності на тканинному рівні у випадках змішаного типу раку шлунка. Вона різко збільшується при високій клітинній та функціональній гетерогенності (77,8% та 83,3%) в порівнянні з помірною гетерогенністю (37,9 та 40%).

8. Виявлена гетерогенність раку шлунка за вуглеводним  складом  муцину, що продукується пухлинними клітинами та за імуногістохімічними особливостям пухлинних кліток, які також  впливають на інвазивність раку шлунка.