ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНІ ВЛАСТИВОСТІ НОВИХ АМІНОКИСЛОТНИХ ПОХІДНИХ 1,4-НАФТОХІНОНУ (експериментальне дослідження) : Церебропротекторное СВОЙСТВА НОВЫХ аминокислотных производных 1,4-нафтохинона (экспериментальное исследование)

summary

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження виконано на 210 нелінійних білих мишах обох статей масою 15-20 г та 731 нелінійному білому щурові обох статей масою 140-410 г, розводки віварію Інституту фармакології та токсикології АМН України. Усі тварини утримувались на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Тварини отримували стандартне харчування у вигляді збалансованого гранульованого корму за встановленими нормами.

Досліди проводились з урахуванням вимог належної лабораторної практики (GLP) згідно з Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗУ (О.В. Стефанов, 2001). Евтаназію тварин проводили шляхом передозування ефіру.

В роботі досліджено 11 оригінальних похідних 1,4-НХ, модифікованих включенням в структуру амінокислотного залишку: лейцину (сполука 15), аргініну (сполука 16), α-аланіну (сполука 17), β-аланіну (сполука 18), гістидину (сполука 19), гліцину (сполука 20), аспарагінової кислоти (сполука 21), глютамінової кислоти (сполука 22), метионіну (сполука 23), тирозину (сполука 24) або аргініну (сполука 25). Усі сполуки синтезовані у Національному університеті «Львівська політехніка» під керівництвом проф. В.П. Новикова і являються калієвими солями, а сполука 25 – сіль лимонної кислоти.

В якості препаратів зрівняння на різних за генезом патологічних станах слугували ампульні розчини емоксипіну 1% (Белмедпрепарат, Білорусь), пірацетаму 20% (Дарниця, Україна), вінпоцетину 0,5% (кавінтон фірми Gedeon Richter, Угорщина).

Гостру токсичність похідних 1,4-НХ вивчали про одноразовому внутрішньоочеревинному (в/о) введенні білим мишам у вигляді водних розчинів 1-5% концентрацій з дотриманням Методичних рекомендацій ДФЦ (О.В. Стефанов, 2001).

Скрінінг церебропротекторної активності проведено на моделі гострого порушення мозкового кровотоку (ГПМК) у наркотизованих (1 серія) та не наркотизованих (2 серія) щурів (двобічна перев’язка загальних сонних артерій). Досліджувані речовини вводили в/о за 45-60 хв до моделювання ГПМК в дозах, що становлять 5% (1 серія) та 1% (2 серія) від ЛД₅₀. Нейропротекторну дію досліджуваних речовин зрівнювали з ефектом пірацетаму і оцінювали за динамікою показника летальності.

Скрінінг антигіпоксичної активності сполук проведено на моделі гострої асфіксії (повне перетискання трахеї) у наркотизованих (тіопентал, 70 мг/кг) щурів. Агтигіпоксичну дію зрівнювали з ефектом емоксипіну в дозі 10 мг/кг в/о (О.В.Дякова, 2005) і оцінювали за тривалістю біоелектричної активності серця  (БЕАС) на ЕКГ. Досліджувані речовини вводили одноразово в/о за 45 хв до відтворення асфіксії.

Для оцінки вікової чутливості церебропротекторну дію найбільш ефективної сполуки 17 досліджено на не наркотизованих дорослих щурах (5-6 міс) та старих тваринах (16-18 міс). Сполуку 17 ( в дозах 0,5-2% від ЛД₅₀) та препарат порівняння кавінтон (в терапевтично ефективних дозах, запозичених із літератури (Т.А. Скочко-Волкова, 2002; Г.І. Степанюк та ін., 2002)) вводили в/о за 60 хв до двобічної перев’язки сонних артерій.

Вплив сполуки 17 та кавінтону, взятих в оптимальних церебропротекторних дозах, на перебіг метаболічних процесів та морфологічної картини ішемізованого мозку вивчали на моделі ГПМК, викликаного однобічною перев’язкою лівої сонної артерії у щурів. Лікування проводили протягом 14 діб двічі на добу з інтервалом 5-6 год. Останнє введення було за 2-3 год до евтаназії тварин. Після декапітації тварин ішемізовану півкулю головного мозку виділяли в холодовій камері (-2^оС) і заморожували в рідкому азоті. Цитозольну фракцію виділяли методом диференціального центрифугування (15000g). Екстракцію ліпідів проводили за методом Р.Кейтс (1974). Безбілковий екстракт отримували шляхом додавання точної наважки гомогенату тканини мозку до хлорної кислоти (0,6 М) з подальшою нейтралізацією 5 М К₂СО₃. Показники енергетичного обміну в безбілковому екстракті мозку (вміст АТФ, АДФ, АМФ, лактату, пірувату, глікогену та глюкози) визначали згідно з методами, описаними в літературі (М.И. Прохорова, 1982; В.В. Меньшиков, 1987). Енергетичний заряд розраховували за формулою (D.E. Atkinson, 1968): .

Вміст креатинфосфату (КФ) визначали за методом Р. Ergliton et al. (1954).

Інтенсивність ПОЛ в ішемізованому мозку оцінювали за вмістом початкових (дієнові кон’югати, ДК) та кінцевих (ТБК-активних, малоновий діальдегід, МДА) продуктів ліпідпереокислення (Л.И. Андреева и др., 1998). Стан антиоксидантної системи захисту організму оцінювали за активністю ферментів каталази (М.А. Королюк, 1988) та СОД (В.А. Костюк и др., 1990).

Дослідження морфологічної структури ішемізованого мозку (фронтальні зрізи сенсомоторної кори) проводили за допомогою гістологічних методів з використанням світлової мікроскопії. Зрізи мозку забарвлювали гематоксиліном і еозином.

Об’ємну швидкість мозкового кровотоку (ОШМК) у загальній сонній артерії наркотизованих (тіопентал-натрій, 70 мг/кг) щурів вимірювали за допомогою флоуметра Transonic Animal Research Flowmeters Т-106 (USA). Після визначення фонового показника досліджувані речовини (сполука 17 в дозі 4 мг/кг, кавінтон – 5 мг/кг) вводили в стегнову вену.

Вплив сполуки 17 та кавінтону на реологічні властивості крові у щурів з ГПМК (перев’язування лівої сонної артерії та обмеження на 50% кровотоку у правій судині за допомогою мідного кільця) оцінювали за вмістом фібриногену в плазмі крові (В.П. Балуда и др., 1980) та активністю тромбопластину в тканині мозку (Г.Н. Липкан и др., 1990). Лікування проводили протягом 5 днів після моделювання ГПМК окремо сполукою 17 та кавінтоном.

Антиконвульсивну активність сполуки 17, кавінтону та карбамазепіну вивчали на  щурах з моделями кордіамінових (300 мг/кг п/ш) та коразолових (80 мг/кг п/ш) судом (А.В. Матвийчук и др., 2004). Сполуку 17 в дозах 3,5-28,0 мг/кг та кавінтон в дозах 5,0-40,0 мг/кг вводили в/о за 30 хв, карбамазепін –     62 мг/кг в/ш (Л.О. Громов, О.О. Євтушенко, 2005). Протисудомну активність оцінювали за динамікою латентного періоду судом, їх тривалістю та за показником ЕД₅₀ - дозою, яка викликала збільшення на 50% тривалості латентного періоду виникнення конвульсій.

Статистичну обробку цифрових даних проводили за методами варіаційної статистики (з визначенням t-крітерія Ст’юдента) та χ² (М.Л. Беленький, 1963), а при нульовому та 100% значеннях показників - за методом Р.Б. Стрєлкова  (1982).

Результати дослідження та їх обговорення.

Скрінінг церебропротекторної активності серед амінокислотовмісних похідних 1,4-НХ проведено на моделі ГПМК, викликаною окремо у наркотизованих та ненаркотизованих щурів шляхом двобічної перев’язки загальних сонних артерій. Встановлено, що попереднє внутрішньоочеревинне введення наркотизованим тваринам досліджуваних 1,4-НХ в дозах 5% від їх ДЛ₅₀ подібно до пірацетаму (100 мг/кг) супроводжується зниженням показника летальності та збільшенням тривалості життя щурів. Ліпше всього ця дія проявилась у сполук з лабораторними шифрами 17, 20, 21 та 22. Так, на 36 год спостереження, коли в контрольній групі мала місце 100% летальність, на тлі дії зазначених сполук цей показник становив відповідно 43, 50, 43 та 43%. Захисна дія пірацетаму в зазначений період експерименту була відсутня. В найбільшій мірі вона проявилась в перші 6 год ГПМК - показник летальності становив 0%, що співпадає з даними літератури (В.И. Скворцова, 2005).

Захисна дія похідних 1,4-НХ при ГПМК чітко проявлялась і у ненаркотизованих щурів. Превентивне внутрішньоочеревинне введення досліджуваних сполук (за винятком сполуки 15) в дозах, що становлять 1% від їх ЛД₅₀, подібно до кавінтону (5 мг/кг) викликало вірогідне зниження показника летальності, що особливо було помітно в критичний період експерименту (перша година), коли в контрольній групі загинуло більше половини тварин з ГПМК. Найбільш ефективною виявилась сполука 17: під її дією, як і під впливом кавінтону, протягом 1 год після моделювання ГПМК була відсутня летальність. На 48 год експерименту на тлі сполуки 17 та референс-препарату показник летальності становив відповідно 30% та 40% проти 100% у контролі.

Оскільки однією з ключових патогенетичних ланок ішемічного ушкодження головного мозку є гіпоксія нейроцитів (Л.Д. Лукьянова, 1997), представляло інтерес охарактеризувати протигіпоксичну дію похідних 1,4-НХ. На моделі гострої асфіксії встановлено, що профілактичне внутрішньоочеревинне введення щурам сполук 16, 17, 18, 19, 22 та 25 в дозах, що дорівнюють 1% від їх ЛД₅₀, подібно до емоксипіну (10 мг/кг в/о), супроводжується вірогідним зростанням тривалості БЕАС. При цьому найбільша ефективність відмічена під дією сполуки 17 - тривалість БЕАС зросла відносно контролю на 92,4% проти 37,3% на тлі емоксипіну. Таким чином, за результатами скрінінгового дослідження, можна зробити висновок, що амінокислотовмісні похідні 1,4-НХ є носіями церебопротекторної та протигіпоксичної активностей, яка в найбільшій мірі притаманна сполуці 17 - калієвій солі 2-α-аланіно-3-хлор-1,4-нафтохінону, яка за величиною захисної дії на наркотизованих щурів з ГПМК не поступається пірацетаму (100 мг/кг), співставляючись з кавінтоном (5 мг/кг) в дослідах на ненаркотизованих тваринах. Цінною властивістю сполуки 17 є наявність у неї достатньо виразного протигіпоксичного ефекту, за величиною якого вона у 2,5 рази переважає емоксипін (10 мг/кг).

Оцінка фармакопрофілактичної дії сполуки 17 на моделі ГПМК

Попереднє введення щурам з двобічною перев’язкою сонних артерій сполуки 17, так само як і кавінтону, справляло позитивний вплив на перебіг ГПМК у тварин різних вікових груп (табл. 1)

При цьому дія обох речовин була дозозалежною і проявлялась зниженням показника летальності у всі терміни досліду, збільшенням тривалості життя щурів та полегшенням перебігу клінічної картини ГПМК. Захисний ефект сполуки 17, на відміну від кавінтону, проявлявся практично в однаковій мірі як у дорослих, так і старих тварин. Кавінтон діяв більш ефективно у дорослих щурів з ГПМК, що співпадає з даними літератури (А.П. Соломонов и др., 1983; А.А.Скоромец, 2002) про більш високу терапевтичну дію препарату у молодих пацієнтів з ішемією головного мозку.