РОЗРОБКА ПРОТИПУХЛИННИХ АУТОВАКЦИН НА ОСНОВІ БІЛОКВМІСНИХ МЕТАБОЛІТІВ B.subtilis В-7025 ТА ЇХ ВПЛИВ НА ОКРЕМІ РЕАКЦІЇ ПРОТИПУХЛИННОГО ІМУНІТЕТУ (експериментальні дослідження) : РАЗРАБОТКА противоопухолевой аутовакцины НА ОСНОВЕ БИЛОКВМИСНЫХ МЕТАБОЛИТОВ B.subtilis В-+7025 И ИХ ВЛИЯНИЕ НА ОТДЕЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ противоопухолевого иммунитета (экспериментальные исследования)

summary

Матеріали та методи дослідження. Представлені в роботі дані одержані на експериментальному матеріалі. Дослідження проводили на мишах ліній C₅₇Bl/6, С₃Н, Balb/c та неімбредних мишах (самці віком 2,5-3,5 міс., масою 19-21 г), які були одержані з розплідника віварію ІЕПОР НАН України. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил проведення робіт з експериментальними тваринами. В експериментальних дослідженнях були використали наступні моделі пухлинного росту: саркома 37 (S37), лімфолейкоз мишей L1210 (L1210), метастазуюча карцинома легені Льюїс (КЛЛ) та рак Ерліха (РЕ). Пухлинні клітини (ПК) КЛЛ, S37 та РЕ перещеплювали внутрішньом’язево (1х10⁶ ПК/тварину); ПК L1210 вводили внутрішньочеревинно (5х10⁵ ПК/тварину).

Для виділення цитотоксичних (ЦТ) компонентів з ФКР Bacillus subtilis В-7025 (10-а доба культивування) були використані наступні методи: етанольна преципітація (Curling J. M.,1980), іонообмінна хроматографія на ДЕАЕ-целюлозі (Ba ard E. A., 1975), колонкова хроматографія з ТOY0PEARL G10 та осадження білків сульфатом амонію (Скоупс Р., 1985). Білковий склад отриманих фракцій (Фр) контролювали за допомогою SDS-електрофорезу; їх цитотоксичну активність визначали in vitro за забарвленням ПК 0,4 % розчином трипанового синього. Морфологічні зміни в ПК, викликані цитотоксичною дією Фр, визначали у фіксованих цитопрепаратах, забарвлених за методом Романовського-Гімза (Козинец Г. И., 1998).

Протипухлинні вакцини (ПВ) виготовляли з використанням отриманих білоквмісних цитотоксичних компонентів ФКР за стандартним методом (Затула Д. Г., 1977), виходячи із співідношення 0,3мг/мл компоненту на 30х10⁶ ПК в 1 мл вакцини. В експериментах in vivo ПВ (або її компоненти) в об’ємі 0,3 мл/тварину вводили на другу добу після перещеплення ПК підшкірно раз на тиждень, протягом 3-х тижнів. ЦТ компоненти вводили за тією ж схемою із розрахунку 0,1 мг/тварину. Імунологічні показники визначали на 7-, 14- та 21-у (або 28-у) добу після початку імунізації. В усіх дослідах тваринам контрольної групи в режимах, аналогічних до описаних вище, вводили підшкірно фізіологічний розчин хлориду натрію.

У всіх групах тварин визначали показники виживаності (%) та середньої тривалості життя (СТЖ). Цитотоксичну активність (ЦТА) лімфоцитів (Лц), макрофагів (Мф), кооперативну ЦТА Мф та Лц, а також антитілозалежну цитотоксичність (АЗЦ) вказаних ефекторів визначали in vitro з використанням МТТ-тесту (Ohno M., 1991; Stanojkovic T. P., 2005; Дворщенко О. С., 2007). В якості клітин-мішеней (КМ) використовували ПК гомологічні перещепленим. Цитохімічну активність перитонеальних Мф оцінювали у НСТ-тесті (Передерий В. Г., 1995). Рівень антитіл (Ат) у сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу (Диденко Г. В., 2003). Крім того, в сироватці крові оцінювали вміст середньомолекулярних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) (Фролов В. М., 2002).

Аналізуючи результати імунологічних досліджень, оцінювали як абсолютні величини відповідних показників, так і індекси їх модуляції (ІМ) відносно аналогічних показників мишей контрольних груп: ІМ=[(Д-К)/К] х100 %. Вплив сироватки визначали за індексом потенціювання: ІП=[(АЗЦ_Лц/Мф-ЦТА_Лц/Мф)/ ЦТА_Лц/Мф] х100 %. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними вимірами оцінювали використовуючи t–критерій Ст’юдента. Вірогідною вважали різницю між порівнюваними показниками при p<0,05. Кореляційний зв’язок між отриманими даними оцінювали за коефіцієнтом кореляції Спірмена (Г. Ф. Лакин, 1980).