Request a thesis ПАТОМОРФОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ТИМУСА ПЛОДІВ ВІД МАТЕРІВ, ХВОРИХ НА ЦУКРОВИЙ ДІАБЕТ I ТИПУ : Патоморфологические особенности тимуса плода от матери, больной сахарным диабетом I типа

Матеріалом дослідження були 64 тимуса антенатально (без ознак мацерації) і інтранатально загиблих плодів від матерів, хворих на ЦД І типу. Групу контролю склали 35 тимусів інтранатально загиблих плодів від матерів з неускладненим перебігом вагітності й пологів.

Матеріал збирався на базах відділень патологічної анатомії Комунального закладу охорони здоров´я Обласна клінічна лікарня та міського патологоанатомічного відділення Спеціалізованого міського клінічного пологового будинку №5 м.Харкова в період із 2001 по 2007р. Також використано архівний матеріал кафедри патоморфології Харківського національного медичного університету за 1985-2000 р.р.

При аналізі історій розвитку пологів, а також протоколів розтинів плодів вивчалися такі дані: вік жінки, давнина й характер перебігу захворювання, наявність судинних ускладнень, характерних для ЦД I типу, схильність до декомпенсації захворювання, кількість попередніх вагітностей і їх результат, термін гестації даної вагітності, патологія пологів, причини антенатальної чи інтранатальної загибелі плода, антропометричні показники й коефіцієнт гармонійності плода, наявність вад розвитку, маса внутрішніх органів.

Серед матерів, хворих на ЦД I типу, 32 мали ЦД I типу легкого ступеня з давниною захворювання не більше 5 років, в 16 спостереженнях був наявний ЦД I типу середнього ступеня тяжкості й тривалістю захворювання від 5 до 10 років. 16 жінок страждали на ЦД I типу тяжкого ступеня більше 10 років чи з раннього дитинства, зі схильністю до декомпенсації й виражених судинних змін.

Мертвонароджені загинули антенатально (пізня антенатальна загибель, плід без ознак мацерації), інтранатально внаслідок гострого порушення матково-плацентарного кровообігу (передчасне відшарування нормально розташованої плаценти, патологія пуповини), а також внутришньочерепної пологової травми.

Об'єктом дослідження послужив тимус плодів досліджуваних груп, вилучений при аутопсії. Орган зважувався, вимірювалися товщина, ширина й довжина залози. З тимуса вирізалися 3 шматочки (із центрального й периферичного відділів). Тканину залози фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну. Після чого матеріал проводився по спиртах зростаючої концентрації. Матеріал заливався в целоїдин-парафін. Виготовлялися серійні зрізи товщиною 5-6 мкм. Зрізи забарвлювалися гістологічними методами: гематоксиліном і еозином, пікрофуксином методом ван-Гізона. Зрізи, забарвлені гематоксиліном і еозином, були використані для визначення загальної будови залоз, наявності змін у паренхімі органу, стану судинного компонента тимуса.

Для імуногістохімічного дослідження використовувалися прямий і непрямий методи Кунса в модифікації M. Brosman (1979). Імунні клітини диференціювали за допомогою МКАт до різних типів клітин (фірма Chemicon, USA). Використовували LT8 (CD8), LT4 (CD4), LT3 (CD3), LT22 (CD22), Thy-1, CD7, CD38, CD95. Крім того, визначали клітини, які експресують рецептори до ІЛ-4, ІЛ-7, HLA-Dr-антигену. Підраховувався імунорегуляторний індекс як співвідношення відносного об'єму CD4 тимоцитів до відносного об'єму CD8 лімфоцитів.

Апоптозно змінені клітини визначали з використанням МКАт CD95 (Novocastra Laboratories Ltd.). Апоптозний індекс обчислювали за формулою: АІ = кількість апоптозних клітин в 1 мм² / щільність клітин в 1 мм²)·100%. Рівень продукції тималіну оцінювався при обробці препаратів полівалентною антисироваткою до тималіну (Росія, Санкт-Петербург).

Ендотелін-1 визначали з використанням МКАт до ендотеліну-1 (Novocastra Laboratories Ltd.). Як люмінесцентну мітку використовували F (ab) 2 - фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші.

За допомогою МКАт до колагенів I, III, IV типів, виявляли колагени в стромальному і судинному компонентах тимуса. Колагени I і IV типів виявляли МКАт фірми Novocastra Laboratories Ltd., колаген III типу – МКАт IMTEK Ltd, Росія.

На серійних зрізах виконувалася морфометрія: визначалися відносні об'єми коркової й мозкової речовини, тілець Гасаля, строми. Обчислювали стромально-паренхіматозний показник, а також співвідношення відносних об'ємів коркової й мозкової речовини. Підраховували щільність тимоцитів в 1 мм² зрізу тимуса в корі й у мозковій речовині. Вивчення препаратів, забарвлених гістологічними методами, а також морфометричне дослідження проводилися на мікроскопі Olympus BX-41 з використанням програм Olympus DP-Soft (Version 3:1) і Microsoft Excel.

Імуногістохімічне дослідження проводилося в люмінісцентному мікроскопі ЛЮМАМ ІЛ-2 з використанням світлофільтрів ФС - 1-2, СЗС - 24, СФС - 24, БС - 8 - 2, УФС - 6 - 3. Інтенсивність світіння визначалася за допомогою ФЕУ-35 і виражалася в умовних одиницях, які дорівнюють струму, що протікає через вимірювальний прилад, виражених у амперах (А).

Статистичний аналіз виконувався за допомогою стандартного пакета програм «Statgraphics».

Оцінка зрілості тимуса плодів здійснювалася власним методом, розробленим здобувачем і співавтором.

Результати дослідження і їх обговорення. Усі вивчені нами плоди були доношеними із терміном гестації 36-40 тижнів. Аналіз протоколів аутопсії плодів від матерів, хворих на ЦД I типу, показав, що антропометричні дані плодів різні й варіюють залежно від тяжкості перебігу материнського діабету. Усі плоди від матерів із ЦД I типу були розділені на три групи: плоди зі зниженою масою тіла (ЗВРП), із середніми антропометричними даними й великі плоди. При зіставленні з даними про перебіг ЦД I типу матері встановлено, що при захворюванні легкого й середнього ступеня тяжкості антропометричні дані плодів відповідають середньостатистичним, що збігається з даними літератури (Н.И. Солонець, 1992). При ЦД I типу середнього ступеня тяжкості з давниною захворювання до 5 років плоди відрізняються збільшенням маси тіла (макросомією). При давнині захворювання більше 10 років, тяжкої форми перебігу зі схильністю до декомпенсації й наявністю виражених судинних ускладнень спостерігається зниження маси тіла плода за рахунок затримки внутрішньоутробного розвитку плода (ЗВРП). Подібно до маси змінюється довжина тіла плода, а також коефіцієнт гармонійності (КГ).

Антропометричні показники плодів групи контролю: маса тіла - 3,23±0,50 (від 2,30 кг до 4,25 кг), довжина тіла - 0,51±0,04 (від 0,40 м до 0,56 м), КГ=21,65±2,60 кг/м³. Для плодів із ЗВРП характерними були такі дані: маса тіла - 2,16±0,30 (від 1,27 кг до 2,40 кг), довжина тіла 0,45±0,02 (від 0,41 м до 0,50 м), КГ=15,9±0,2 кг/м³. У групі плодів середньої ваги відзначались такі зміни антропометричних параметрів: маса тіла - 3,29±0,40 (від 2,70 кг до 3,95 кг), довжина тіла - 0,50±0,03 (від 0,4 м до 0,5 м), КГ=21,5±0,9 кг/м³. Антропометричні показники великих плодів склали: маса тіла - 4,47±0,40 (від 4,1 кг до 6,0 кг), довжина тіла - 0,54±0,02 (від 0,51 м до 0,60 м), КГ=27,43±0,30 кг/м³.

Розвиток великопліддя зумовлений у першу чергу обмінними порушеннями, а саме хронічною гіперглікемією плода, а також змінами в судинах фето-плацентарного комплексу, що призводять до передчасного дозрівання плаценти. Наявність виражених змін у судинах сприяє затримці дозрівання фето-плацентарного комплексу й недостатності кровообігу, тому плід розвивається в умовах хронічної гіпоксії й, як наслідок, народжується зі зниженою масою тіла. Розвиток плодів із ЗВРП можна пояснити ще зниженням активності гормональних систем як материнського, так і плодового організму, що призводить до переваги ліполізу над ліпосинтезом (Д.А. Евсеенко, Ю.В. Ещенко, 2002).

При макроскопічному дослідженні тимуси плодів групи контролю, плодів середньої ваги і плодів із ЗВРП були представлені двома частками й покриті сполучнотканинною капсулою. Тоді як у більшості спостережень у групі великих плодів від матерів із ЦД I типу, тимус складався з 3-х часток, у трьох спостереженнях – з 4-х часток. У всіх спостереженнях тканина залози на розрізі була сірувато–синявою, дрібнозернистою, м'яко–еластичної консистенції. Маса залози змінювалася відповідно до антропометричних даних плода, досягаючи максимальних значень у групі великих плодів від матерів із ЦД I типу (30,4±3,0∙10ˉ³ кг), мінімальних показників – у групі плодів із ознаками ЗВРП (8,3±0,2·10ˉ³ кг) і перевищувала значення в групі контрольних спостережень у плодів середньої ваги (15,5±0,4·10ˉ³ кг).

Оглядове мікроскопічне дослідження не виявило істотних розходжень у будові тимусів досліджуваних груп. Усі залози були представлені часточками різного розміру й форми, у яких чітко визначалася коркова й мозкова речовина. Однак, при визначенні відносних об'ємів основних структурних компонентів тимусів було виявлено, що в групі плодів середньої ваги від матерів із ЦД I типу відносні об'єми структурних компонентів тимуса відповідали таким у групі контролю, тоді як у групі плодів із ЗВРП спостерігалася тенденція до зниження відносного об'єму кори на фоні тенденції до збільшення відносних об'ємів мозкової речовини (р<0,05) і вірогідного збільшення відносного об'єму тілець Гасаля (р<0,05). У групі великих плодів разом із тенденцією до збільшення відносного об'єму кори спостерігалася тенденція до зниження відносних об'ємів тілець Гасаля й строми (р<0,05). Наводимо показники відносних об'ємів основних структурних компонентів тимусів плодів досліджуваних груп. Показники групи контролю: відносний об´єм кори - 43,70 ± 0,22%, мозкової речовини - 37,70±0,17%, тілець Гасаля - 6,80 ± 0,15%, строми - 9,70 ± 0,19%. Відносні об´єми структурних компонентів тимусів плодів із ЗВРП: кори - 38,06±0,18%, мозкової речовини - 40,10±0,22%, тілець Гасаля - 11,40±0,18%, строми - 10,78±0,15%. У групі плодів середньої ваги визначалися такі показники: кора - 44,30±0,26%, мозкова речовина - 39,82±0,19%, тільця Гасаля - 6,52±0,18%, строма - 9,29±0,18%. Показники відносних об´ємів структурних компонентів тимусів великих плодів: кори - 49,18±0,25%, мозкової речовини - 37,87±0,15%, тілець Гасаля - 5,56±0,12%, строми - 7,37±0,20%.

У плодів із ознаками ЗВРП відносний об'єм коркової речовини знижений, а мозкової – підвищений, отже, знижений і показник співвідношення кора / мозкова речовина. Подібні зміни пояснюються надлишковим розвитком сполучної тканини під впливом гіпоксії; зміною структури судинних і інтерстиційних колагенів (стовщення ретикулоепітеліального каркаса, порушення міграції тимоцитів); незрілістю епітеліального компонента (порушення продукції цитокінів: збільшення клітин, які експресують на своїй поверхні рецептори ІЛ-7, що стимулюють проліферацію лімфоїдного компонента). Виявлено збільшення відносного об'єму тілець Гасаля. Однак незважаючи на достатню кількість останніх, звертає на себе увагу те, що більшість із них дрібні і складаються з 3-5 клітин. При цьому явища кератозу й кальцифікації, як відомо, характерні для зрілих тілець вилочкової залози, практично не спостерігалися. Зустрічалися поодинокі кістоподібно змінені екземпляри. Вищеописаний морфологічний стан тимічних тілець, згідно з сучасною науковою літературою, відповідає стадії їхнього формування, тоді як у нормі до моменту народження дитини вони повинні бути повністю сформовані. Незрілість тимічних тілець може відбиватися на стані лімфоїдного компонента. З огляду на роль тимічних тілець як своєрідного подразника для ретикулоепітеліального компонента тимуса, незрілість тілець буде сприяти порушенню дозрівання й функціональної незрілості останнього, що, у свою чергу, призведе до порушення процесів дозрівання, проліферації й диференціації лімфоїдного компонента.

У тимусах великих плодів наявні такі зміни величин відносних об'ємів основних структурних компонентів. Разом із вірогідним збільшенням відносного об'єму коркової речовини, відносний об'єм мозкової речовини був незначно знижений, відносні об'єми тимічних тілець і строми були ймовірно знижені. Нечисленні тільця Гасаля в мозковій речовині кістовидно змінені з явищами кальцифікації, кератинізації й петрифікації, що є ознакою перенапруження й виснаження епітеліального компонента.

Очевидним є те, що вищеописані зміни відносних об'ємів кори й мозкової речовини тимусів досліджуваних плодів пов'язані зі зміною щільності клітинних елементів. Показники щільності клітинних елементів мозкової речовини в тимусах плодів досліджуваних груп: групи контролю - 7643,941±270,639 екз. в 1 мм², плодів із ЗВРП - 5885,8±114,2 екз. в² 1 мм, плодів середньої ваги - 7019,545±134,223 екз. в 1 мм², великих плодів - 8948,25±96,79 екз. в 1 мм². Показники щільності клітинних елементів кори в тимусах плодів досліджуваних груп: групи контролю - 12526,35±202,52 екз. в 1 мм², плодів із ЗВРП - 7578,733±239,824 екз. в 1 мм², плодів середньої ваги - 12005,33±153,21 екз. в 1 мм², великих плодів - 16644,19±126,94 екз. в 1 мм².

Як випливає з наведених даних, у тимусах плодів із середніми антропометричними даними показники щільності клітинних елементів практично досягають таких у групі контрольних спостережень, у тимусах плодів із ознаками ЗВРП вони вірогідно знижені, а в тимусах великих плодів вірогідно підвищені (р<0,05). Причому, зміни показників щільності клітинних елементів кори й мозкової речовини перебувають у тісному прямому взаємозв'язку (r=+0,99) (p<0,05).

Нами показано, що між масою тимуса й щільністю клітинних елементів у корі й мозковій речовині має місце тісний прямий взаємозв'язок (r=+0,98) (p<0,05).

З використанням МКАт до колагенів вивчено особливості колагеноутворення в тимусах плодів від матерів із ЦД I типу. Колаген I типу виявлявся в стромі як коркової, так і мозкової речовини. У складі базальних мембран судин і периваскулярних просторів у групі контролю переважав колаген IV типу, тоді як у тимусах плодів від матерів із ЦД І типу був наявний колаген III типу (P.D. Dale et al., 1996). Наводимо показники інтенсивності світіння колагенів І, ІІІ та ІV типів в тимусах плодів досліджуваних груп. Так, показники світіння колагену І типу дорівнювали: група контролю - 2,11±0,05 10ˉ³ А, плоди із ЗВРП - 4,18±0,09∙10ˉ³ А, плоди середньої ваги - 4,23±0,07∙10ˉ³ А, великі плоди - 5,12±0,06∙10ˉ³ А. Інтенсивність світіння колагену ІІІ типу в досліджуваних групах досягала: група контролю - 6,89±0,80∙10ˉ³ А, у плодів із ЗВРП - 14,51±1,70∙10ˉ³ А, у плодів середньої ваги - 11,25±1,10∙10ˉ³ А, у великих плодів - 12,34±1,30∙10ˉ³ А. Дані інтенсивності світіння колагену ІV типу: група контролю - 1,13±0,04∙10ˉ³ А, плоди із ЗВРП - 5,22±0,08∙ˉ³ А, плоди середньої ваги - 4,45±0,09∙10ˉ³ А, великі плоди - 5,98±0,07∙10ˉ³А.

Поява колагену III типу в складі базальних мембран епітелію й судин спричиняє розвиток дистрофічних змін в епітеліальних клітинах, а також призводить до порушення дозрівання й міграції лімфоцитів, чим, очевидно, і зумовлене підвищення показника щільності клітинних елементів кори й мозкової речовини в тимусах плодів від матерів із ЦД I типу (H.J. Kuo et al., 1997). Підвищення колагеноутворення у свою чергу зумовлено хронічною гіпоксією й гіперглікемією, в умовах яких розвивається плід у матері із ЦД I типу (В.І. Медведь, М.І. Солонець, 2002).

Впливом хронічної гіперглікемії й гіперінсулінемії зумовлене посилення експресії рецепторів судин до ендотеліну-1 (Л.А. Могильницький, Б.М. Маньковський, 2001). Інтенсивність світіння ендотеліну-1 артеріями дорівнювала: в групі контроля - 9,12∙10ˉ³ А, в групі плодів із ЗВРП - 15,33∙10ˉ³ А, в групі плодів середньої ваги - 15,45∙10ˉ³ А, в групі великих плодів - 16,34∙10ˉ³ А. У венах визначалися такі показники світіння ендотеліна –1: в групі контроля - 14,32∙10ˉ³ А, у плодів із ЗВРП - 16,99∙10ˉ³ А, в групі плодів середньої ваги - 17,23∙10ˉ³ А, в судинах тимусів великих плодів - 18,54∙10ˉ³ А. Звертає на себе увагу посилення інтенсивності світіння ендотеліну-1 у судинах як артеріального, так і венозного типу, більше виражене у венах. Зміна ендотеліальної активності судин зумовлена впливом гіперглікемії й гіперінсулінемії на регуляцію виділення й дії ендотеліну-1. В умовах гіперглікемії можуть спостерігатися як зниження, так і посилення продукції ендотеліну-1. Водночас високі концентрації інсуліну крові призводять до односпрямованих змін, а саме до посилення експресії рецепторів до ендотеліну-1, а також збільшення кількості їх в умовах тривалої гіперінсулінемії. Очевидним є, що умови хронічної гіперглікемії й підвищеного рівня інсуліну крові, у яких розвиваються плоди при материнському ЦД, можуть бути одним із факторів описаної нами посиленої експресії рецепторів судин до ендотеліну-1. Між інтенсивністю світіння ендотеліну в артеріях і венах при ЦД I типу виявляється прямий тісний взаємозв'язок (r=+0,99) (р<0,05), що вказує на одночасне посилення експресії рецепторів до ендотеліну-1 в артеріальному й венозному ендотелії. Посилення інтенсивності світіння ендотеліоцитів судин артеріального й венозного типу прямо позитивно пов'язано з масою тіла й масою тимуса плода (при порівнянні з масою тіла плода, коефіцієнт кореляції склав r=+0,29 для судин артеріального типу й r=+0,37 для судин венозного типу (р<0,05). При порівнянні інтенсивності світіння ендотеліоцитів артеріальних і венозних судин з показниками маси тимуса плода, r=+0,33 і r=+0,41, відповідно) (р<0,05). Ендотелін-1, як відомо, здатний підсилювати синтез колагену в судинах і може бути провідним фактором розвитку вищеописаних склеротичних процесів у тимусах плодів від матерів із ЦД I типу (A.G. Wangel et al., 1998).