ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ КОМБИНАЦИИ ГЛИЦИНА, МАГНИЯ И ГАМК ПРИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ : ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАНЯ ВИКОРИСТАННЯ ЛІКАРСЬКОЇ КОМБІНАЦІЇ ГЛІЦИНУ, МАГНІЮ І ГАМК ПРИ ЦЕРЕБРАЛЬНІЙ ІШЕМІЇ

summary

  Матеріали та методи досліджень. Експериментальна частина виконана на 84 білих нелінійних мишах, 437 статевозрілих білих нелінійних щурах-самцях, масою 200–250 г та 70 монгольських піщанках (гербілах) масою 45 – 60 г. Тварини отримані з віварію ДУ ,,Інститут фармакології і токсикології АМН України”. Тварини знаходилися на стандартному раціоні харчування, в умовах природної зміни дня і ночі. Усі експериментальні процедури здійснювали відповідно до Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України (О.В. Стефанов, 2001), вимог Європейської конвенції із захисту хребетних тварин (Страсбург, 1986) та Статуту Української асоціації з біоетики та норм GLP (1992). Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації під наркозом (тіопентал-натрій, 40 мг/кг).

            Під час проведення досліджень нейрофармакологічного профілю для визначення ефективної дози гліцину використовували білих нелінійних мишей, з якими проводили гіпоксичний тест. Тварин поміщали в герметично закритий контейнер, викликаючи гіпоксичну гіпоксію (К.П. Іванов, 1988; Е.А. Ільїн, 1966). Про ступінь антигіпоксичної активності робили висновки на основі подовження часу до першого апное у тварин. Другу серію дослідження ефективної дози проводили на білих щурах. Тваринам моделювали амнезію навику шляхом введення атропіну (40мг/кг внутрішньоочеревинно). Про наявність антиамнестичної активності свідчило збереження навички в тесті умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) (Я.Буреш, О.Бурешова, 1991; М.Я. Головенко, 2002).

Здатність гліцину підвищувати толерантність нейронів до глутаматної ексайтотоксичності досліджували in vitro на суспензії нейрональних клітин (М.І. Прохорова, 1982) до якої додавали глутамінову кислоту (100 мкмоль), каїнат (200 мкмоль) або N-метил-D-аспартат (200 мкмоль) (А.А. Болдирєв, 2000). Для дослідження морфофункціонального стану нейронів готували мазки, які фарбували нітратом срібла для виявлення апоптичних та дегенеративно змінених нейронів (Я.Буреш, О.Бурешова, 1991).

            Оскільки метою нашої роботи було дослідження нейропротективної активності гліцину та його комбінацій, то були необхідні експериментальні моделі, адекватні клінічним проявам інсульту. Таким вимогам відповідає модель необоротної білатеральної оклюзії загальних сонних артерій, яку ми використовували для відтворення ішемічного інсульту на білих щурах (О.В.Стефанов, 2002). Для відтворення клінічної картини геморагічного інсульту вводилася аутокров під тверду оболонку головного мозку (S.Takizawa, 1991). При використанні в експериментах монгольських піщанок нами враховувалися видові анатомічні особливості кровопостачання головного мозку у цих тварин, а саме роз'єднаність велізієвого кола мозкового кровообігу. Тому цим тваринам проводили оборотну двосторонню оклюзію сонних артерій, шляхом накладання оклюдера тривалістю 30 хвилин на тлі артеріальної гіпотензії (пентамін 20 мг/кг) (К. Yamamoto, 1986).

Усі досліджувані речовини вводили тваринам внутрішньочеревно один раз на день починаючи з виходу щурів з наркозу протягом 4 діб (гострий період ішемічного та геморагічного інсульту) та 18 діб (відновлювальний період). Терапію гербілів проводили протягом однієї доби (гострий період) та 7 днів після моделювання ішемії-реперфузії.

Досліджувались такі препарати: гліцин у дозі 200 мг/кг, МgCl₂ – 15 мг/кг, «Магнелонг» – 1 мл ін’єкційного розчину на 100 г маси, препарат порівняння – пірацетам вводили у дозі 500 мг/кг.

У тварин, яким моделювали різні типи гострого порушення мозкового кровообігу, оцінювали реакції орієнтовно - дослідницької поведінки в тесті «відкрите поле». У щурів протягом 3 хвилин реєстрували горизонтальну (число квадратів, які перетинала тварина), вертикальну (число вертикальних рухів) та дослідницьку (число заглядань у «нірки») активність (А.Г.Вартанян, В.С. Петров, 1989; Я. Буреш, О. Бурешова, 1991).

Про когнітивний дефіцит експериментальних тварин робили висновки за їх здатністю до навчання і запам'ятовування аверсивного стимулу в тесті УРПУ (Я. Буреш, О. Бурешова, 1991), який проводили після закінчення спостереження у відновлювальний період порушення мозкового кровообігу.

            Вираженість неврологічного дефіциту визначали за шкалою McGrow (С.Р. McGrow, 1977) протягом усього часу спостереження. Тяжкість стану визначали за сумою відповідних балів: до 3 балів – легкий ступінь, від 3 до 7 балів – середній ступінь і від 7 балів і вище – важкий ступінь. Відзначали парези, паралічі кінцівок, тремор, манежні рухи, птоз, положення на боці, рухливість; також як прояв неврологічного дефіциту розглядали утримування щурів на стрижні, діаметром 15 см, який обертався зі швидкістю 3 об/хв. Тварин тестували щодня, виставляючи суму балів.

Для оцінки ступеня ішемічного пошкодження тканин мозку та ефективності фармакологічної корекції проводили біохімічні дослідження тканин головного мозку. Для біохімічних досліджень використовувалися скроневі долі кори головного мозку тварин. Тканини гомогенізувалися в сольовому ізотонічному розчині (0,15М KCl) при охолодженні (до +4⁰С) за допомогою скляного гомогенізатора у співвідношенні 1:40. Після виділення ядер та незруйнованих клітин (1000g) методом диференційного центрифугування (15000 g) виділялася цитозольна фракція (М.І. Прохорова, 1982). Для оцінки інтенсивності ВРО в тканинах головного мозку визначали ступінь окислювальної модифікації білків (ОМБ) (В. Halliwell, 1999), рівень малонового диальдегіду (МДА) (Л.І. Андрєєва, 1988), дієнових коньюгатів (ДК) і триєнкетонів (ТК) (Р. Кейтс, 1974).

Стан антиоксидантної системи визначали за показниками активності супероксиддисмутази (СОД) (С. Чеварі, 1988), каталази (М.А. Королюк, 1988) і ГПР у тканинах мозку (М.І. Прохорова, 1982).

Цикл оксиду азоту вивчали за накопиченням стабільних метаболітів NO у головному мозку (Н.В. Горбунов, 1995), за рівнем активності NO–синтази (Ю.М. Колесник, 2005), а також за концентрацією L-аргініну в головному мозку (В.В. Зинчук, 1999).

Процеси вуглеводно–енергетичного обміну та окислення в циклі Кребса в головному мозку оцінювали за рівнем аденілових нуклеотидів (АТФ, АДФ, АМФ) (Н.Б. Захарова, 1980), лактату, малату, ізоцитрату (М.І.Прохорова, 1982), активності сукцинатдегідрогенази (СДГ) і цитохромоксидази (ЦХО) (В.С. Асатиані, 1969).

Стан ГАМК-ергічної системи головного мозку вивчали за концентрацією гліцину, ГАМК, глутамату (В.В. Зинчук, 1999) та активністю ключових ферментів – глутаматдекарбоксилази (ГДК) – ферменту, відповідального за утворення ГАМК з глутамату, і ГАМК-трансамінази (ГАМК-Т) – ферменту, відповідального за перетворення ГАМК у процесі його гальмівної дії (В.А. Розанов, 1980).

Для проведення морфометричних та гістоімунохімічних досліджень тканини головного мозку експериментальних тварин поміщали на 24 години у фіксатор Буена і після стандартної гістологічної проводки тканину розміщували у парафіні (Е. Пірс, 1962).

Для вивчення морфології нейроні зрізи фарбували для визначення нуклеїнових кислот галоціанін–хромовими галунами за Ейнарсоном (Е. Пірс, 1962). Для виявлення експресії c-fos і Всl-2 білка в сенсомоторній зоні фронтальної кори використовували імуногістохімічний метод непрямої імунофлюоресценції (A.P. Johnstone, 1997). Зображення Fos–імунопозитивних нейронів та bcl-2– імунопозитивних нейронів сенсомоторної зони, що отримували на мікроскопі, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4922 (COCHU Inc., США) вводили до комп'ютерної програмно-апаратної системи цифрового аналізу зображення VIDAS (Y.M. Kolesnik et al., 2002).

Статистичну обробку даних проводили з використанням параметричного критерію t-Стьюдента, однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA), непараметричного U–критерію Уїтні-Манна у рамках програми MS Excell. Вірогідними вважали відмінності з рівнем значення більше 95% (Л. Закс, 1976).

            Результати дослідження та їх обговорення. Встановлено, що гліцин у дозі 200 мк/кг виявляє антигіпоксичну та антиамнестичну дію. При додаванні в інкубаційне середовище, що містить глутамат (100 мкмоль), гліцин у кількості 100 мкмоль зменшував загибель нейронів на 11,7% (р<0,05). Внесення гліцину у дозі 0,1 мкмоль сприяло активації нейродегенеративних процесів, що виявлялося у збільшенні загиблих нейронів відносно показників контролю (суспензії з додаванням глутамату). Це явище пояснюється тим, що гліцин є коагоністом NMDA-рецепторів і в мікромолярних концентраціях сприяє активації рецепторного комплексу (П.В. Сергеєв, 1999). При додаванні до інкубаційного середовища іонів магнію (15 мкмоль) нейропротективна активність гліцину (100 мкмоль) посилювалася на 28,3% (р<0,05) відносно контрольної серії (рис. 1). Іони магнію є неконкурентними потенціалзалежними антагоністами NMDA-рецепторів, які блокують їх активацію шляхом зв’язування зі своїм сайтом в іонному каналі (V. Bruno, 1995).