ФАРМАКОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ СПІЛЬНОГО ЗАСТОСУВАННЯ ГУМІНАТУ І СУЛЬФАЦИЛУ НАТРІЮ ПРИ ЗАХВОРЮВАННЯХ РОГІВКИ : Фармакологические исследования ОБЩЕГО ПРИМЕНЕНИЯ ГУМИНАТУ И СУЛЬФАЦИЛ НАТРИЯ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ роговицы

summary

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проводили в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ ім. В. П. Філатова АМН України, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 31 від 2006 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ІОХіТТ (протокол № 8 від 7.11.2006 р.) та Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2003).

Роботу виконано в дослідах in vitro на моделі культури клітин і стандартних тест-штамах мікроорганізмів, а також in vivo в умовах гострого і хронічного експериментів на 137 кролях породи Шиншила, масою 1,8-2,2 кг, 14 морських свинках, масою 280-300 г,  вирощених у розпліднику віварію ІОХіТТ. Всі тварини обох статей були статевозрілі,  пройшли карантин і утримувалися на стандартному раціоні віварію за встановленими нормами.

Нами розроблено препарат гумінат у двох стандартних формах: порошок і розчин натрієвої солі гумінових кислот торфу (ТУ У 24.4-02012094-002-2001). Для проведення досліджень за лабораторним регламентом із сертифікованого торфу Івано-Франківського родовища (ТУ У 24.1-0549158-001-2001) були виготовлені: 0,1 % і 1 % розчини гумінату, 10 % та 20 % розчини сульфацил-гумінату. Останній містить n-параамінобензол-сульфацетамід натрію і натрієві солі гумінових кислот торфу, амінокислоти, мікроелементи (Патент України № 64624 А від 16.02.04. р. „Очні краплі”). В якості референтного препарату використовували очні краплі – 10 % і 20 % сульфацилу натрію (ВАТ «Фармак», Україна).

Визначення цитотоксичності дослідних розчинів проводили (in vitro) на культурі перещеплюваних клітин нирок ембріону людини RH. Облік результатів здійснювали через 24, 48, 72, 144, 168 год. експозиції шляхом візуальної оцінки цілісності моношару. Ступінь дегенерації моношару клітин оцінювали за 4-х плюсовою системою, через 168 годин підраховували кількість життєздатних клітин (нежиттєздатні забарвлювались у синій колір після фарбування 0,01 % трипановим синім) [Єлизарова О. Н., Рязанова Р. А., 1982; Toth G. M., 1974]. Вплив розчинів на мітотичну активність клітин та частоту патологічних мітозів вивчали на цитопрепаратах культури клітин, зафіксованих і пофарбованих за методом Романовського-Гімза [Голубев Д. Б., 1976; Desai I. S. et al., 1974; Wart H. E., 1990], відповідно до Методрекомендацій (1998).

Антимікробну активність визначали методом дифузії в агарi на стандартному поживному середовищі АГВ з використанням еталонних тест-штамів мікроорганізмів (НДКІ ім. Л. А. Тарасевича): Staphylococcus aureus АТСС 25923 F-49; Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 F-51; Bacillus subtilis АТСС 6633; Escherichia coli АТСС 25922. Чутливість мікроорганізмів до розчинів оцінювали за величиною діаметра зони затримки росту: до 15 мм - малочутливі, до 25 мм - чутливі, більш 25 мм - високочутливі [Биргер М. О., 1998; ДФУ 1, 2001].

Вивчення офтальмонешкідливості очних лікарських форм проводилося згідно з Методрекомендаціями ДФЦ МОЗ України (2003). Виявлення місцевої алергізації (кон’юнктивальна проба) 20 % сульфацил-гумінату і 0,1 % гумінату проводили на двох групах морських свинок (по 7 тварин). Розчини інстилювали в праве око (дослід), в ліве око (контроль) – 0,9 % розчин хлориду натрію. Оцінку проводили за трьохбальною шкалою: 1 бал – легке почервоніння  слізного протоку; 2 – почервоніння  слізного протоку і склери в напрямку до рогівки; 3 – почервоніння всієї кон’юнктиви і склери. Реакцію на препарат визначали через 15 хв (негайна) і через 24-48 годин (гіперчутливість уповільненого типу). Контрольна перевірка офтальмосприйнятності і місцево-подразнюючої дії проводилась на 14 кролях: 0,1 % гумінат і 20 % сульфацил-гумінат інстилювали шість разів на день на протязі 7 днів (підгостра офтальмотоксичність), згідно попередній схемі.

Другий етап вивчення нешкідливості 20 % сульфацил-гумінату включав 14-денні інстиляції (субхронічна офтальмотоксичність) і 30-денне застосування їх (хронічна офтальмотоксичність). Дослідження проводили на 33 кролях (66 очей), розподілених на 3 групи: 1 група – 20 % сульфаціл-гумінат, 2 - 0,1 % гумінат, яким на протязі 4-х тижнів, тричі на день препарати інстилювали в обидва ока, 3-тя група – інтактні кролі. До початку досліду, через 2 і 4 тижня проводили зовнішній огляд, біомікроскопію, флуоресцеїнові проби, офтальмоскопію, визначали вміст в периферичній крові еритроцитів, лейкоцитів, гемоглобіну, підраховували лейкоцитарну формулу. Біохімічні показники крові - глюкозу, сечовину, загальний білок визначали за загальноприйнятими стандартними методиками [Меньшиков В. В., 1987; Горячковский А. М. , 1998]. На 14-й день виводили з експерименту по 3 кроля з кожної групи методом повітряної емболії під тіопенталовим наркозом для гістоморфологічних досліджень тканин рогівки і кон’юнктиви. Гістопрепарати забарвлювали гематоксиліном і еозином [Архангельский В. Н., 1960; Лили Р., 1969]. За рештою кролів спостерігали протягом місяця.

Лікувальну ефективність 20 % сульфацил-гуминату вивчали при моделюванні у кроликів ерозії рогівки,  травматичного і бактеріального кератитів [Чайка Л. А. и др., 2003].

Поверхнева ерозія рогівки виконувалась на обох очах 20 кролів після місцевої анестезії 0,5 % розчином дикаїну. В центральній частині рогівки трепаном діаметром 6 мм наносили неглибоку насічку, в межах якої скальпелем з поверхні рогівки знімали епітелій. Тварини були розподілені на 4 групи (по 5  в кожній), яким тричі на день інстилювали: 1- група - 0,1 % гумінат; 2 – 20 % сульфацил-гумінат; 3 – 20 % сульфацил натрію; 4  – 0,9 % розчин хлориду натрію (контрольна патологія).

Травматичний кератит моделювали на 18 кролях (36 очей). По центру зони поверхневої ерозії скальпелем призводили горизонтальний розріз і в його межах розшаровували поверхневі шари рогівки. Тварини були розподілені на три  групи: 1 група - інстиляції  20 % сульфацил-гумінату, 2 – 20 % сульфацилу натрію, 3 – 0,9 % розчин хлориду натрію (контрольна патологія).

Бактеріальний кератит моделювали у 31 кролика (62 ока). Спочатку відтворювали травматичний кератит, після чого в очі тричі інстилювали по    0,5 мл двох млрдн. зависі патогенної добової бульйонної культури золотистого стафілокока, з інтервалом в 1 годину. Через добу у кролів з’являлися клінічні ознаки гнійного кератиту. Тварини були розподілені на 3 групи: перша група (11 кролів) – отримувала 20 % сульфацил-гумінат; друга (10) – 20 % сульфацил натрію; третя (10) – 0,9 %  розчин хлориду натрію (контрольна патологія).  Всім кролям щоденно закапували 1 % розчин атропіну сульфату.  Контрольну групу без патології склали сім інтактних кролів. Інстиляції проводили в обидва ока тричі на день на протязі двох тижнів.

Клінічний перебіг модельованих уражень рогівки оцінювали за результатами мікробіологічних досліджень виділень з ока, біомікроскопії, характеру запального процесу (за шкалою Дрейза), фотореєстрації. Враховували початок і кінець епітелізації рогівки, розсмоктування інфільтрату, стихання запальної реакції ока, наявність ускладнень, наслідки захворювання і віддалені результати через місяць [Осташевский В. Л., 1982; Чайка Л. А. и др., 2003; Дрожжина Г. И., 2006].

Біохімічні дослідження проведено на 21 кролі при моделюванні бактеріального кератиту. Визначали вихідний рівень активності ферментів та на 3, 7, 14 день експерименту в плазмі крові за загальноприйнятими методами: кислу фосфатазу (КФ) - Дингл, 1980; катепсин Е (КЕ) – Меньшиков В. В., 1987; Barret, 1972; аспартат-амінотрансферазу (АсАТ) і аланін-амінотрансферазу (АлАТ) - Меньшиков В. В., 1987; трипсиноподібні протеїнази (ТП) – Чеснокова Н. Б., 1995; лактатдегідрогеназу (ЛДГ) - Bergmeyer, 1970.

На 14-й день з експерименту виводили по 7 кролів з кожної групи для біохімічних та гістоморфологічних досліджень рогівки ока. Для оцінки стану мембран лізосом визначали неседиментуючу і седиментуючу активність кислої фосфатази і катепсину Е [Покровский А. А., 1976; Дингл, 1980].