СТРУКТУРНО – ФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ ДВАНАДЦЯТИПАЛОЇ КИШКИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ КРІОГЕННОМУ ПАНКРЕАТИТІ ТА ЇХ КОРЕКЦІЯ

summary

Матеріали і методи дослідження. Дослідження виконане на 87   статевозрілих білих лабораторних щурах-самцях. Маса тіла експериментальних тварин складала 195-205 г. Вони утримувались на стандартному раціоні віварію. Всі маніпуляції з експериментальними тваринами проводили із дотриманням правил, передбачених Європейською комісією по нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю експериментальних тварин різних видів, а також згідно „Науково-практичних рекомендацій із утримання лабораторних тварин та роботи з ними” (Кожем’якін Ю.М., 2002). Комісією з питань біоетики державного вищого навчального закладу “Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського” (протокол №15 від 18.01.2008 р.) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено. Експеримент проведено у Центральній науково-дослідній лабораторії державного вищого навчального закладу “Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського”, що акредитована на право проведення вимірювань, які знаходяться в сфері державного метрологічного нагляду. Атестат акредитації № 001488 від 3.10.2003 р., Свідоцтво про атестацію № 000478 від 17.12.2007 р.

Піддослідні тварини були розділені на три групи : 1-а група – 11 інтактних тварин;  2-а група – 40 білих щурів, в яких був змодельований кріогенний панкреатит різної тривалості; 3-я група – експериментальні тварини з аналогічною патологією (36 особин), яким щоденно з першого дня експерименту внутрішньошлунково вводили сорбент ГСГД та препарат антиоксидного та гепатопротекторного спектру дії Ліволін форте. Тварин з експериментально змодельованим кріогенним панкреатитом та його корекцією виводили з експерименту на 2-у, 7-у та 14-у доби.   Добова доза сорбенту -  1 мл (що відповідає чистій масі вуглецевого сорбенту ГСГД 0,2 г) на 100 г маси тіла тварини.  Препарат Ліволін форте вводили внутрішньошлунково в добовій дозі поліненасиченого фосфатиділхоліну (лецитину) 150 мг на  100 г маси тіла тварини. Доза препаратів була обгрунтована на підставі Методичних рекомендацій з доклінічного вивчення лікарських засобів (Стефанова О.В., 2001).

Експериментальне ураження підшлункової залози у білих щурів  моделювали шляхом локального заморожування обох її поверхонь хлоретилом згідно методики С.О. Шалімова (1989). Контрольним тваринам проводили ідентичну лапаротомію без заморожування підшлункової залози. Через 2, 7 та 14 діб з моменту кріогенного ураження підшлункової залози тварин виводили з експерименту кровопусканням в умовах тіопентал-натрієвого знечулення.

Для гістологічних досліджень матеріал забирали у тварин всіх груп. Після видалення дванадцятипалої кишки (ДПК) вирізали із середньої частини органу шматочки для мікроскопічного дослідження. Матеріал фіксували  в 10 % розчині нейтрального формаліну з триразовою зміною фіксатора, зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5–6 мкм, забарвлені гематоксиліном і еозином, досліджували і документували за допомогою мікроскопа ЛОМО Биолам И.

Забір матеріалу для електронномікроскопічного дослідження ДПК проводили згідно загальноприйнятої методики. Для дослідження вибирали шматочки із середньої частини ДПК. Матеріал фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду з активною реакцією середовища рН 7,3-7,4, виготовленому на фосфатному буфері Міллоніга (Уіклі Б., 1975). Фіксований матеріал через 50–60 хвилин переносили у буферний розчин і промивали протягом 20–30 хвилин. Постфіксацію здійснювали 1 % розчином чотириокису осмію на буфері Міллоніга протягом 60 хвилин, після чого проводили  дегідратацію в спиртах і ацетоні та заливали в суміш епоксидних смол. Ультратонкі зрізи, виготовлені на ультрамікротомі УМПТ-7, забарвлювали 1 % водним розчином уранілацетату, контрастували цитратом свинцю згідно методу Рейнольдса та вивчали в електронному мікроскопі ЕМ-125К.

 Вагоме місце серед морфологічних досліджень посідають морфометричні методи, які дають можливість більш об’єктивно оцінити морфофункціональний стан гістологічних структур в нормі, а також прослідкувати закономірності перебігу компенсаторних реакцій в них (Автандилов Г.Г., 2002). Морфометричні та кількісні дослідження проводили, використовуючи систему візуального аналізу гістологічних препаратів. Зображення на монітор комп’ютера  виводили з мікроскопу ЛОМО Биолам И за допомогою відео-камери Vision CCD Camera  і програми InterVideoWinDVR. Морфометричні дослідження проведені за допомогою програм Відео Тест 5,0 KAAPA Image Base та Microsoft Exel на персональному комп’ютері.

Морфометрично у гістологічних препаратах визначали товщину слизової оболонки ДПК, її підслизової основи, м’язової та серозної оболонок, товщину власної пластинки слизової оболонки, товщину м’язової пластинки слизової оболонки, висоту й товщину ворсинок, глибину й ширину просвіту крипт, висоту стовпчастих епітеліоцитів з облямівкою в медіальній частині ворсинок (Автандилов Г.Г., 1990, Саркісов Д.С., 1997 ). Про регенерацію епітеліоцитів, яка є надзвичайно важливим механізмом відновлення клітин при експериментальному кріогенному панкреатиті, судили за швидкістю їх проліферації. Враховуючи те, що оновлення епітелію кишки здійснюється за рахунок розмноження стовпчастих епітеліоцитів без облямівки,. ми вивчали співвідношення  числа клітин, що знаходяться в різних фазах мітозу, до загального числа клітин у крипті і виражали цей показник у вигляді мітотичного індекса (Лиознер Л.Д., 1977, Саркисов Д.С., 1977, Тимашкевич Т.Б., 1978, Паушева З.П., 1974).

Концентрацію циркулюючих імунних комплексів  (ЦІК) у сироватці крові досліджували загальноприйнятим методом преципітації в поліетиленгліколі (ПЕГ 6000) (Гриневич Ю.А., 1981, Киркин Б.В., Халиф И.Л., Осипов С.Г., 1985, Сooper K.M., Moore M., 1983 ). Оцінку розмірів та патогенності імунних комплексів проводили згідно методу Н.О. Константинової та співавторів (1989). Зміни концентрацій імуноглобулінів A, M, G у сироватці крові визначали біохімічним методом (Лоренко С.В., 1972).  Фагоцитарну активність лейкоцитів (ФАЛ) цільної крові визначали, використовуючи культуру Staphylococcus aureus  Р-209 (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978).

Стан пероксидації ліпідів оцінювали за рівнем проміжних продуктів, а саме  дієнових кон’югатів (ДК) (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983) і компоненту кінцевого метаболізму - малонового диальдегіду (МДА) (Андреев А.И., Кожемякин Л.А., 1988). Також вивчали активність ферментів системи антиоксидного захисту (АОС) – каталази (КТ) згідно методики  М.А. Королюка і співав. (1988),  супероксиддисмутази (СОД) (Чевари С., Чаба И. Секей Й., 1985), пероксидазної активності крові (ПАК) (Попов Т., Нейковська Л., 1971) і церулоплазміну (ЦП) (Колб В.Г.,  Камышников В.С., 1976).  Керуючись даними  літератури про те, що при експериментальному кріогенному панкреатиті виникає значна інтоксикація організму, зумовлена в основному середньомолекулярними пептидами (СМП), ми одночасно з вивченням інших показників  визначали рівень середніх молекул в плазмі крові піддослідних тварин згідно відповідної методики з обчисленням коефіцієнту середньомолекулярних пептидів (Ксмп), як відношення СМП₁ до СМП₂, де СМП₁ – це вміст СМП, визначений при довжині хвилі 254 нм, а СМП₂ - вміст СМП, визначений при довжині хвилі 280 нм (Габриэлян Н.И., Липатова В.И., 1984, Копытова Т.В., Добротина Н.А., Боровков Н.Н., 1991, Николайчик В.В., Моин В.М., Кирковский В.В., 1991).

Ступінь інтоксикації організму оцінювали за еритроцитарним індексом інтоксикації (ЕІІ) – за кількістю поглинутого барвника (метиленового синього) еритроцитарними мембранами (Тогайбаев А.А., Кургузкин А.В., Рикун  И.В., 1988).

Отриманий в результаті експерименту цифровий матеріал був систематизований та оброблений за допомогою методів варіаційної статистики із використанням критерію Стьюдента (Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2002).

Результати досліджень та їх обговорення. Проведені нами дослідження вказують на те, що за умов експериментального панкреатиту у дослідних тварин розвиваються гострі реактивні зміни в стінці ДПК, які охоплюють усі структурні компоненти її слизової оболонки та підслизової основи. При цьому виражених структурних порушень у серозній та м’язовій оболонці ДПК не спостерігалось.

На 2 добу спостереження після експериментальної кріодеструкції підшлункової залози гістологічно встановлено, що зміни в будові ДПК пов’язані з вираженими судинними розладами. При світлооптичному дослідженні стінки ДПК у тварин із змодельованим панкреатитом на 2 добу досліду встановлено розширення і повнокрів’я судин у вигляді агрегації формених елементів крові, явища периваскулярного набряку, а також потовщення і деформацію ворсинок, набряк сполучної тканини власної пластинки, збільшення кількості келихоподібних клітин як у криптах, так і на ворсинках, гіпертрофію дуоденальних залоз, інфільтрацію пухкої сполучної тканини слизової оболонки і підслизової основи лімфоїдними і плазматичними клітинами, що можна трактувати як активізацію захисних факторів.

На 7 добу досліду зміни в структурних компонентах ДПК наростали, що виражалося деструкцією апікальної частини ворсинок, пош­кодженням і частковою десквамацією стовпчастих епітеліоцитів, набряком строми ворсинок, ознаками гемостазу в елементах гемомікроциркуляторного русла, переповненям секретом келихоподібних клітин, гіпертрофією дуоденальних залоз.

На 14 добу досліду ступінь вираженості змін в стінці ДПК був меншим, що проявлялося зменшенням набряку строми ворсинок, частковим руйнуванням їх апікальної частини, зменшенням кровонаповнення судин стінки ДПК, пролі­ферацією епітелію крипт, нормалізацією стану дуоденальних залоз. Описана динаміка свідчить, що на 14 добу у слизовій оболонці ДПК відмічається тенденція до зменшення деструктивних та посилення регенераторних процесів.

Проведене морфометричне дослідження гістологічних препаратів стінки ДПК тварин з екс­пе­ри­ментальним панкреатитом, виявило істотні зміни будови її стінки. Слід відмітити, що ступінь пошкодження структурних компонентів стінки ДПК залежала від тривалості змодельованого патологічного процесу в підшлунковій залозі. Так, товщина слизової оболонки досліджуваного органа на 7 добу спостереження на 6,5 % перевищувала аналогічний показник у групі інтактних тварин. Відмічали статистично достовірне потовщення підслизової основи, яке спостерігалося у всі терміни спостереження, в основному за рахунок вираженої гіпертрофії дуоденальних залоз.  Так, на 2, 7 та 14 доби експерименту цей показник був вищим відповідно у 1,2; 1,3 та 1,1 рази порівняно з аналогічним у групі інтактннх тварин (рис. 1).

Слід відмітити, що висота ворсинок практично не відрізнялася від контрольного показника на 2 та 14 доби експерименту, однак на 7 добу зростала, достовірно перевищуючи аналогічний показник у групі інтактних тварин.