СИСТЕМА ІМУНОРЕГУЛЯЦІЇ ТА ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ЇЇ ПОРУШЕННЯ У ХВОРИХ НА HCV-ІНФЕКЦІЮ : СИСТЕМА иммунорегуляции и прогностическое значение ЕЕ НАРУШЕНИЯ У БОЛЬНЫХ HCV-ИНФЕКЦИЕЙ

summary

Загальна характеристика обстежених хворих та методи дослідження. Роботу виконано на кафедрі інфекційних хвороб Харківської медичної академії післядипломної освіти та клінічній базі Харківської обласної клінічної інфекційної лікарні.  

Для виконання поставлених задач обстежений 155 хворих на HCV-інфекцію, серед них ГГС встановлено у 23,9 %, ХГС – 76,1 %, віком від 18 до 70 років, які перебували на стаціонарному лікуванні в обласній клінічній інфекційній лікарні м. Харкова в 2004-2007 рр. Серед обстежених хворих на ГГС та ХГС переважали особи чоловічої статі (67,6 та 72% відповідно), середній вік склав (30,5±2,2 і 33,8±1,1 років відповідно).

Діагноз встановлювали на підставі клініко-анамнестичних, епідеміологічних, лабораторних та інструментальних даних. Етіологічну верифікацію діагнозу здійснювали виявленням у сироватці крові специфічних серологічних маркерів ГС (анти-HCV (сум), анти-HCV IgM і Ig G, анти-HCV core та анти-HCV NS-3, NS-4, NS-5) методом ІФА. Клініко-патогенетичні варіанти перебігу, форму та ступінь тяжкості ГС визначали згідно із загальноприйнятими в клінічній практиці критеріями (МКХ-10). Діагноз ХГ встановлювали відповідно до сучасної міжнародної класифікації хвороб печінки (1994). З метою оцінки функціонального стану печінки пацієнтам проводилося дослідження у сироватці крові вмісту загального білірубіну та його фракцій, активності АлАТ, показників загального білка та білкових фракцій за загальноприйнятими методиками. Усім хворим здійснювалось УЗД органів черевної порожнини на апараті ТІ 628А виробництва НДІРІ (Україна) з використанням датчиків частотою 3,5 МГц за стандартною методикою.

Молекулярно-генетичні дослідження включали визначення реплікативної активності HCV на підставі виявлення в сироватці крові РНК HCV якісним методом ПЛР за допомогою тест-систем виробництва НВФ “Литех” (Росія). Генотипування HCV методом рестрикційного аналізу здійснювали за допомогою тест-систем “АмплиСенс” (Росія).

З метою визначення особливостей сероконверсії АТ до різних епітопів НCV проведено дослідження вмісту антитільного спектру крові у 37 хворих на ГГС в динаміці в періоді розпалу (на 7,4 ± 0,3 день жовтяниці), повторно – в періоді клініко-біохімічної ремісії на 30 ± 1,6 день від початку жовтяничного періоду перед випискою із стаціонару, а також 118 хворим на ХГС при госпіталізації, використовуючи тест-системи виробництва НВО «Вектор ВЕСТ» (Росія).

Імунологічні дослідження включали визначення основних субпопуляцій лімфоцитів (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD16⁺, CD20⁺, CD25⁺), загальної кількості Ig A, M, G, ЦІК та рівнів цитокінів (ФНП-α, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10, ІФН-γ) у сироватці крові. Основні субпопуляції лімфоцитів периферичної крові визначали методом імунофлюоресцентної мікроскопії з використанням набору моноклональних та поліклональних АТ для визначення диференційних АГ лімфоцитів людини виробництва ООО „Сорбент” (Росія) відповідно до інструкції виробника. Для дослідження вмісту Ig А, М, G в сироватці крові застосовували метод простої радіальної імунодифузії в гелі. Концентрацію ЦІК в крові хворих визначали за методикою Діжона. Для визначення рівнів ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-10, ІФН-γ в сироватці крові використовували тест-системи ООО “Протеиновый контур” (Росія), а для ФНП-α  – ООО “Цитокин” (Росія), користуючись інструкцією виробника.

Імунологічні показники вивчали в периферичній крові 30 хворих на ГГС у динаміці захворювання – у періоді розпалу та клініко-біохімічної ремісії, після проведеної терапії та 60 хворих на ХГС – до призначення імуномоделюючої терапії та після її закінчення. Особливості імунного статусу із визначенням якісного та кількісного складу його показників аналізували залежно від цитолітичної активності, наявності в крові хворих молекулярно-генетичних маркерів активності реплікації та генотипу HCV. Залежно від активності сироваткової АлАТ хворі на ХГС розподілилися наступним чином: по 10 (16,7 %) відповідно з нормальною та мінімальною і 40 (66,6%) хворих із помірно підвищеною активністю. Для виявлення особливостей стану імунної системи залежно від реплікативної активності HCV проводили порівняльну характеристику вмісту імунних показників у 45 (75%) хворих на ХГС із позитивним та 15 (25%) хворих із негативним результатами ПЛР-дослідження  наявності  в крові НСV РНК. Для визначення закономірностей змін імунного статусу залежно від генотипу вірусу проводилася порівняльна оцінка вмісту імунологічних показників у хворих на ГГС та ХГС із найбільш поширеними генотипами HCV – 1b та 3a. Для встановлення ефективності проведеної терапії вивчалася динаміка імунологічних показників 90 хворих на ГС (30 на ГГС та 60 на ХГС), із них 35 (15 на ГГС та 20 на ХГС) хворих, окрім загальноприйнятої базисної терапії отримували ін’єкції імунофану, а 55 (15 на ГГС та 40 на ХГС) хворих отримували лише базисну терапію.

Базисна терапія включала обмежувальний режим, дієтичне харчування (стіл № 5а чи 5), полівітаміни. При необхідності застосовувалися дезінтоксікаційні засоби (5% розчин глюкози, 0,9% розчин NaCL, реосорбілакт), рибоксин, спазмолітики, гепатопротектори (після нормалізації клініко-біохімічних показників), інші препарати.

Імунофан призначали за стандартною схемою протягом 3 місяців (по 50 мкг (1,0 мл) 0,005% розчину внутрішньом’язово 1 раз в три дні (курс 10 ін’єкцій) трьома курсами з інтервалом між ними 10 днів). У хворих на ХГС після закінчення третього курсу терапії введення імунофану продовжували до 6 місяців у такій же дозі один раз у 7 днів (підтримуюча схема). У хворих на ГГС лікування імунофаном починали на 10-14 день хвороби, на ХГС – при позитивних тестах індикації HCV РНК у сироватці крові. Ефективність проведеної терапії у хворих на HCV-інфекцію оцінювали на підставі клінічних даних, досягнення біохімічної (нормалізація рівня сироваткової АлАТ) і вірусологічної (зникнення РНК HCV або зниження рівня віремії) ремісії відповідно до рекомендацій Європейської групи по вивченню печінки (Eurohep, 1996).

Статистична обробка результатів дослідження була здійснена за допомогою Microsoft Excel 2007 (ліц. № RW2FR-7DFDD-TCF8J-9K9BJ-MJ678) на комп'ютері Pentium II Celeron 850 PPGA

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При вивченні епідеміологічного анамнезу встановлено, що найбільше значення в інфікуванні вірусом ГС мали вказівки на штучні парентеральні втручання, які включали лікувально-діагностичні медичні та косметологічні маніпуляції (58,7%), внутрішньовенне введення наркотичних речовин (27,7%). Статевий шлях як можлива причина інфікування мав місце у 6,5% пацієнтів. У 7,1% хворих конкретні шляхи інфікування не встановлені.

Гострий перебіг HCV-інфекції реєструвався у 23,9% хворих. В переджовтяничному періоді переважав (43,3%) змішаний (астеновегетативний в поєднанні з диспепсичним) синдром. В періоді розпалу відмічалися помірно виражені інтоксикаційний та диспепсичний синдроми, рівень загального білірубіну в середньому підвищувався до 73,2±4,4 мкмоль/л, активність АлАТ – до 14,07±0,65 ммоль/л·год; розміри печінки збільшувалися у 100% хворих (в середньому на 2,04±0,2 см). У всіх хворих спостерігалася жовтянична форма та легкий перебіг захворювання.

В клініці ХГС домінували астеновегетативний (71,2%) і диспепсичний (35,6%) синдроми, гепатомегалія (100%) та спленомегалія (34,7%), жовтяниця виявлялася у 1/5 хворих, при цьому середній рівень загального білірубіну склав 25,1±3,77 (максимальний – 44 мкмоль/л); активність сироваткової АлАТ досягала 3,5±0,2 ммоль/л·год. Тривалість захворювання склала орієнтовно (3,6±0,4) роки. У всіх хворих встановлена маніфестна форма ХГС.

Дослідження сероконверсії до різних епітопів білків вірусу ГС дозволило виявити, що анти-HCV (сум) визначалися в сироватці крові всіх хворих на ГС. Частота виявлення та спектр АТ до антигенних детермінант структурного та неструктурних білків НСV залежала від строків захворювання. В періоді розпалу анти - НСV Ig M виявлялися у сироватці крові 100% хворих на ГГС, при повторному дослідженні в середньому через 30±1,6 днів частота їх виявлення вірогідно знижувалася і досягала 75,7% (p<0,05). У хворих на ХГС анти - НСV Ig M виявлялися рідше – 65,3% (р<0,05). Анти-HCV core (сум) в перші 10 днів жовтяниці виявлялися у 73% хворих на ГГС, ймовірно, за рахунок Ig М. При повторному обстеженні через 30±1,6 днів від початку жовтяниці у цих же хворих частота реєстрації анти - HCV core зростала до 81,1%, що, можливо, пов'язано із підвищенням Ig G. Майже у всіх хворих на ХГС (98,3%) були виявлені анти - HCV core (сум). Серед неструктурних білків привертає увагу висока частота реєстрації анти-HCV NS3 в періоді розпалу ГГС (75,7%). Повторне обстеження в динаміці виявило підвищення частоти виявлення цих АТ (86,5%). В періоді розпалу ГГС анти-HCV NS4 та анти-HCV NS5 не виявлялися, але в подальшому, через 30±1,6 днів від початку жовтяничного періоду, частота їх визначення склала 67,6 % та 48,6% відповідно. При хронічному перебігу ГС анти-HCV NS3 виявлялися практично у всіх хворих (97,5 %), а анти - HCV NS4 та анти - HCV NS5 – у 91,5% та 72,9% хворих відповідно, при цьому анти-HCV NS5 визначалися вірогідно рідше порівняно з анти-HCV NS3 та анти-HCV NS4 (р<0,05).

Аналіз молекулярно-генетичних досліджень показав, що РНК НСV визначалася в периферичній крові хворих на ГГС (100%) та ХГС (77,89 %). Генотип HCV 1b виявився найбільш поширеним як серед хворих на ГГС (50%), так і ХГС (43,3%). Друге місце зайняв генотип 3а – у 30% та 38,3% хворих на ГГС та ХГС відповідно. У хворих на ГГС з однаковою частотою зустрічалися комбінація 1b/3а та 2 генотипи HCV – у 10 % хворих відповідно. Комбінація 1а/3а та ізольований генотип 1а серед хворих на ГГС не визначався. У хворих на ХГС комбінація 1b/3а виявлялася у 6,7%. З однаковою частотою (5,0%) реєструвалися комбінації 1а/3а та 3а генотипи відповідно. 2 генотип відмічався досить рідко – у 1,7 % хворих на ХГС.

У хворих на ГГС в періоді розпалу були вірогідно знижені в крові відносна та абсолютна кількість субпопуляцій лімфоцитів: CD3⁺, CD4⁺, ІРІ порівняно з такими показниками контрольної групи (р<0,05), (табл.1). Одночасно з цим спостерігалось вірогідне підвищення відносних та абсолютних показників лімфоцитів з фенотипом CD16⁺, CD20⁺, CD25⁺ порівняно з аналогічними показниками контрольної групи (p<0,05). Також в цей період спостерігалось вірогідне підвищення середніх показників ФНП-a, ІЛ-2, ІФН-γ порівняно з контрольною групою (p<0,05), (табл. 2). Найвищими  виявилися рівні ІФН-γ та ІЛ-2, середні показники яких вірогідно перевищували відповідні рівні контрольної групи. Так, середні концентрації ІФН-γ в сироватці хворих на ГГС в 4,7 рази перевищували показники контрольної групи, а ІЛ-2 – в 3,4 рази (p<0,05). В періоді розпалу виявлялося вірогідне збільшення вмісту СD20⁺, ЦІК, Ig М, рівнів ІЛ-4 та ІЛ-10 порівняно з таким в контрольній групі (p<0,05). В періоді клініко-біохімічної ремісії спостерігались вірогідні зміни вмісту імунокомпетентних клітин порівняно з аналогічними показниками у розпалі ГГС. Так, абсолютні та відносні показники СD3⁺, СD4⁺, СD16⁺ та СD25⁺ вірогідно знижувалися порівняно з аналогічними показниками, виявленими у хворих в періоді розпалу ГГС (p<0,05).