ВПЛИВ АКТИВАТОРІВ АТФ-ЗАЛЕЖНИХ КАЛІЄВИХ КАНАЛІВ НА ЕЛЕКТРОФІЗІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ГЛАДЕНЬКИХ М’ЯЗІВ СЕЧОВОДУ ССАВЦІВ ПРИ АУТОІМУННОМУ УРАЖЕННІ : ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ АТФ-зависимых калиевых каналов НА Электрофизиологические свойства гладких мышц Мочеточника млекопитающих ПРИ аутоиммунное поражение

summary

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на  ізольованих  смужках гладеньких м’язів сечоводу людини і морських свинок з використанням методики одинарного та подвійного сахарозного містка для відведення електричної активності – потенціалів дії ( ПД і ан – і кателектротонічних потенціалів) і реєстрації ізометричного скорочення (Артеменко и др., 1982).

Взяття експерементального матеріалу від пацієнтів із клінікою гострого обструктивного пієлонефриту проводилось лише під час хірургічних втручань на нирці з дотриманням норм біоетики ( Перший Національний  конгрес з біоетики, Київ 2000). Із отриманих  поздовжніх смужок сечоводу, взятих від рівня ниркової миски чи мисково-сечовідного сегменту (для збереження спонтанної активності) довжиною 1 - 2 см. шириною 0,2 - 0,5 см. готували 3 - 4 препарати (шляхом розрізання в довжину волокна), які поміщали в розчин Кребса-Ханзеліста (в мілімолях: NaCl - 118.4; KCl - 4.7; NaHCO₃ - 15.5; MgSO₄ - 1.2; CaCl₂ - 2.5; KH₂PO₄ - 1.2; глюкоза -11.5 (pH 7.4) з подальшою фіксацією в експериментальній камері для відведення ПД (за допомогою хлорсрібних електродів) і реєстрації скоротливої активності за допогою механо-електричного перетворювача сили в електричний сигнал (FT 106).

Контролем слугували смужки сечоводу, взяті під час патолого - анатомічного розтину людей (не пізніше ніж 10 годин після смерті) померлих від загальних хвороб (ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба, інсульт).

Потенціали дії викликались короткими (5-10мс) прямокутними імпульсами постійного електричного струму. Ан - і кателектротонічні потенціали викликали дією прямокутних імпульсів постійного струму (силою 10^-7 А і тривалістю до 5с). Перед дослідженням гладеньком’зові смужки закріплювалися в експерементальній камері. Їх перфузували протягом 30 хв. сольовим розчином Кребса для врівноваження частоти і амплітуди скорочення. В залежності від мети експерименту смужки перфузували розчином хлориду калію (60, 30, 25 або 15 ммоль/л). Робочі розчини насичували газовою сумішшю 9,5% О₂ і 5% СО₂, рН 7.4. Автоматичний термостат дозволяв підтримувати температуру розчину в експериментальній камері 37 ± 0,5 ^оС.

Для проведення експериментів на ізольованих смужках сечоводу тварин використовували морські свинки (самці і самки) масою 0,3 – 3,5 кг з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (Міжнародна конвенція, Страсбург, 1985). Підготовка препаратів сечоводу морських свинок для дослідження дії нових активаторів К_АТФ - каналів гладеньких м’язів і антитіл була такою, як описано для ГМК сечоводу людини.

Кров (до 50 мл) для імунологічних реакцій (визначення титру аутоантитіл) у хворих з клінікою гострого обструктивного пієлонефриту брали із кубітальної вени. Кожен хворий був попереджений про важливість взяття матеріалу для дослідження та давав письмову згоду, що відмічено в кожній історії хвороби. Контролем слугували зразки сироватки крові, взятих у хворих із діагнозом сечосольового діатезу та призовників, які проходили обстеження у відділенні та в процесі обстеження урологічної патології у них не виявлено.

Аутоантитіла проти отриманих білків актоміозину (сечоводу людини і морських свинок) виявляли методом імуноферментного аналізу (ELISA) з модифікаціями (Matsiota et ol. 1987). Препарати актоміозину із тканини (сечоводу, кровоносних судин, нирок, серця, скелетного м’язу) отримували за методом Мargossion S.(1985). Для виявлення антитілопозитивних хворих використовували рівень антитіл (аутоантитіл), що перевищував аналогічні титри у групі здорових донорів на велечину 1д (стандартне відхилення).

Імуноблотинг найбільш реактивних сироваток проти досліджуваних антигенів проводили за відомим методом (Te ynck et ol.,1990).

Електрофорез отриманих білкових препаратів проводили у градієнті концентрацій ПААГ (поліакриламідний гель) (7-22%) в денатуруючих умовах за Laemmli (1970), а також у 14,5% ПААГ.

Із отриманих імуноактивних сироваток виділяли антитіла (г- АТ- сумарна гама-глобулінова фракція) шляхом висолювання за допомогою сірчано - кислого амонію (Фримель, 1987). Концентрацію білку визначали за методами Лоурі- Фоліна (Lowry et аl., 1951), а також Бредфорда (Bredford, 1976). Для контрольних дослідів використовували сироватку крові здорових донорів, із якої виділяли загальну гама-глобулінову фракцію описаним вище методом.

Нові фторвмісні активатори К_АТФ - каналів (ПФ - 5 і ПФ - 10) були надані розробниками (академіком НАН України Мойбенком, професором Ягупольським), за що автор щиро вдячний. Перед використанням активатори калієвих АТФ - каналів розчиняли в диметилацетаміді. Глібенкламід розчиняли в суміші з диметилсульфоксиду і етилового спирту (1:1). Глібенкламід, пінацидил, диметилсульфоксид були виробництва «Sigma Chemical» (США). Активатори і блокатори вивільнення гістаміну відповідно речовина 4880 клемастин використовували фірми Sandoz (Швеція).

Результати дослідження обробляли методом варіаційної статистики за допомогою редактора MS Excel 2003, та програмового пакета Statistica 6.0.  

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА  ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Ефекти нових активаторів калієвих каналів на ізольовані м’язові смужки сечоводу іn vitro. Встановлено, що у відповідь на електричне подразнення міоцити нормального сечоводу людини генерували складної форми ПД, їх амплітуда складала 31,8 ± 2,1 мВ, а тривалість - 1,33 ± 0,1с (n=19). Розвиток ПД супроводжувався формуванням фазних скорочень, сила яких знаходилась в межах від 20 до 100 мН, а їх тривалість складала 2,3 ± 0,3 с  (n=19). Амплітуда ПД міоцитів сечоводу морської свинки складала 28,7 ± 2,4 мВ, а тривалість – 0,74 ± 0,26 с (n=52). Сила фазних скорочень визначалася варіабельністю і коливалася в межах 2,0 – 12 мН (n=52).

При порівнянні з результатами, отриманими від нормального сечоводу та при досліджуваній патології з’ясувалося, що швидкість наростання пікових потенціалів, їх амплітуда плато і амплітуда скорочення були значно меншими за контрольні. Відмінності в реакції гладенько’язових клітин сечоводу при обструктивному пієлонефриті спостерігалися за дії гіперкалієвого розчину та гістаміну. При цьому амплітуда скорочень була значно меншою від контрольної величини. Зменшення реактивуючого впливу гістаміну на міоцити при гострому обструктивному пієлонефриті, можливо, обумовлено десенсибілізацією гістамінових рецепторів через високі концентрації в крові біологічних амінів і медіаторів запалення. За умов патологічного стану, викликаного обструктивним пієлонефритом, порушується скоротлива здатність міоцитів, що може впливати на зміну просвіту сечоводу. Таке твердження випливає із того, що при цьому захворювані зменшується амплітуда скорочень, швидкість наростання пікових потенціалів і тривалість плато, викликаних електричним подразненням чи гіперкалієвим розчином.

При дослідженні порівняльної дозо-залежної дії активаторів К_АТФ - каналів ПФ - 5 і ПФ - 10 виявилося, що їх порогові концентраційні ефекти суттєво відрізняються. Так, для ПФ - 5 вона складала 0,001 мкмоль, а для ПФ - 10 – 0,0031 мкмоль.