МІЖПІВКУЛЬОВА НЕЙРОФАРМАКОЛОГІЯ НООТРОПІВ (експериментальне дослідження) : Межполушарной нейрофармакологии ноотропы (экспериментальное исследование)

summary

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження виконані на 547 білих статевозрілих нелінійних щурах масою 160 - 220 г та 55 монгольських гербелах масою 150 - 170 г. Тварини належали до обох статей, утримувалися на стандартному раціоні харчування віварію. Всі експериментальні процедури і оперативні втручання здійснювали відповідно до «Положення про використання тварин в біомедичних дослідженнях».

Об’єктами фармакологічних досліджень були 4 ноотропних препарати, які за хімічною структурою наближаються до структури молекули ГАМК: 1) аміналон  - 250 мг/кг (капсули по 250 мг, «Київський вітамінний завод», Україна); 2) пірацетам - 500 мг/кг (розчин для ін’єкцій, 20% ампули по 5 мл, ЗАО фармацевтична фірма «Дарниця», Україна); 3) фенібут - 250 мг/кг (субстанція, Олайнський ХФЗ, Латвія); 4) пікамілон - 50 мг/кг (таблетки по 50 мг, «Акрихин», Росія).

Поведінкові реакції вивчалися з використанням методу „відкрите поле” (Я. Буреш и соавт., 1991). До уваги брали показники горизонтальної і вертикальної рухової активності, кількість обстежених норок (дослідницька активність), кількість болюсів дефекації і актів грумінгу (емоційна напруга).

Згідно до даних, що активізація цілеспрямованих рухів відбувається переважно під контролем лівої півкулі, яка чинить активуючий вплив на локомоцію, в той час, як права пригнічує її, була використана методика визначення ступеню активності лівої гемісфери, застосована у роботах Г.П. Короткої (2002). Інтенсивність рухів щурів визначалася за кількістю перетнутих квадратів «відкритого поля» за перші 3 хвилини спостереження. Проводилось 4 досліди на кожній тварині кожного дня на протязі 4 діб. Активність лівої гемісфери оцінювалась шляхом визначення коефіцієнту асиметрії (Кα) за формулою:  Кα=Q/t,

де Q- загальна кількість перетнутих квадратів за час (t) 4 дослідів.

Потім розраховували натуральний логарифм значення Кα, як це прийнято для досліджень з показниками функціювання головного мозку (А.С. Батуев, 1986).

Порівняння міжпівкульової протиішемічної активності проводили шляхом формування симетричних двобічних зон ішемії у великих півкулях мозку у лабораторних тварин за допомогою загальноприйнятих методик моделювання експериментального ішемічного інсульту. У білих щурів здійснювали двобічну незворотню перев’язку загальних сонних артерій, у гербелів відтворювали модель тимчасової 15-ти хвилинної оклюзії ЗСА з обох боків з наступною реперфузією. Оперативні втручання робились за подібною схемою під тіопенталовим наркозом (40 мг/кг, інтраперітонеально) з використанням хірургічного доступу до каротидних артерій та накладанням на відповідні судини шовкової лігатури у щурів, зажиму у гербелів (Шалимов и др., 1989). Зміни неврологічного дефіциту у гербелів оцінювали згідно до stroke-index (P. McGraw, 1977).

Ноотропні препарати, що досліджували при експериментальному інсульті головного мозку, вводили з першої доби ішемії щоденно на протязі 18 діб після моделювання патологічного стану у вказаних вище дозах. У лабораторних тварин витягували окремо праву та ліву півкулю головного мозку для біохімічних, гістохімічних та морфометричних досліджень.

Для біохімічних досліджень фронтальні ділянки кори великих півкуль заморожувались в рідкому азоті. Заморожені в азоті тканини головного мозку гомогенізували. Екстракцію цитозольної фракції розводили 0,15 М розчином KCl з розрахунку тканина : розчин КСl 1:40 (М.И. Прохорова, 1982). Методом диференційного центріфугування при t 4° С при 1500 g виділяли цитозольну фракцію. Супернатант зливали в чисті пробірки. З осаду проводили екстракцію ліпідів 5,0 мл гептан-ізопропанольною сумішшю (2:1) за методом Кейтса (1974), безбілковий екстракт одержували додаванням точної наважки гомогенату тканини в хлорну кислоту (0,6 М) з подальшою нейтралізацією 5М К₂СО₃ по метилоранжу (Коган В. С. и др., 1988, М.И. Прохорова, 1982). Вміст ТБК-залежних продуктів (МДА) визначали спектрофотометрично за методикою, описаною Л.И. Андрєєвою та співав. (1988), вміст дієнових кон’югатів (ДК), трієнкетонів (ТК) (Коган В. С. и др., 1988).

Вплив ноотропних речовин на стан вуглеводно – енергетичного обміну та цикл Кребса вивчали в обох півкулях за рівнем аденілових нуклеотидів – АТФ, АДФ, АМФ (М.И. Прохорова, 1982), лактату, малату (G.H. Hohorst, 1970), пірувату за методом Цоха-Ломпрехта (М.И. Прохорова, 1982).

Стан антиоксидантної системи в обох півкулях мозку щурів оцінювали за активністю ферментів супероксиддісмутази (СОД) за методикою С.Чеварі та співавт., 1988, каталази за методикою М.А. Королюк, 1988,  глутатіонпероксидази (ГПР) (Т.О. Кругликов, Ц.М. Штурман, 1976, И.Ф. Беленичев, 1996) та вмісту антиоксиданта α-токоферолу (Коган В. С. и др., 1988).

Показники окислювальної модификацїї білка в тканинах головного мозку визначали за методом B. Halliwell (1999). При взаємодії окислених амінокислотних залишків з 2,4-динітрофенілгидразином (2,4-ДНФГ) утворюються 2,4-динітрофенілгидразони – альдегідні (АФГ) і карбоксильні (КФГ) групіровки амінокислотних залишків.

Для морфологічних досліджень у тварин після декапітації витягувалися ліва та права півкуля головного мозку, які потім 24 години фіксувалися в 10% рідині Буена (Э.Пирс, 1962), далі, за стандартною схемою, поміщалися в парафінові блоки, з яких готували 5-мікронні гістологічні зрізи в області постцентральної звивини (соматосенсорна кора). Для вивчення морфофункціонального стану клітин IV-V шарів кори мозку гістологічні зрізи депарафінували в ксилолі, проводили регідратацію в спадних концентраціях етанолу (100%, 96%, 70%)_, відмивали у фізіологічному розчині та офарблювали галоцианін-хромовим галуном за Ейнарсоном (1962) для специфічного виявлення РНК.

Дослідженню піддавали зону IV-V шарів кори в лівій та правій півкулях. Вивчення морфометричних характеристик нейронів проводили на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Зображення, що отримали на мікроскопі Axioscop, за допомогою високочутливої відеокамери COHU-4722 (COHU Inc., США) вводилося в комп'ютерну систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Etektronik, Німеччина). Морфометричний аналіз клітин мозку здійснювали в автоматичному режимі за допомогою макропрограми, розробленої в спеціалізованому середовищі програмування VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). Вивчали характеристики щільності, площі тіл нейронів та гліальних клітин, концентрація РНК та кількість апоптотичних та деструктивно змінених нейронів, характеристики одержувались по кожній клітині у полі зору (Y.M.Kolesnik et al., 2002).

Для виявлення експресії c-fos и Всl-2 –білка використовували імуногістохімічний метод непрямої імунофлюоресцеції. Спочатку на зрізи наносили первинні антитіла до белка c-fos и Всl-2 (Sigma Chemical, USA ) та інкубували при +4⁰ С 24 години. Після інкубації зрізи трийчі промивали 0,1 М фосфатним буфером. Потім на зразки наносили вторинні антитіла (флюоресцент кон’югирований козій IgG) (Sigma Chemical, USA) та інкубували при кімнатній температурі 60 хв. Після інкубації зрізи промивали 0,1 М фосфатним буфером. На флюоресцентному мікроскопі Axioskop (Ziess, Germany) досліджували Fos-імунопозитивні нейрони та Всl-2-імунопозитивні нейрони, за допомогою відеокамери COHU – 4922 (USA)  та вводили в систему цифрового аналізу зображення VIDAS –386 ( Kontron Elektronic, Germany). Та за кількостю нейронів у зрізах, що дають флюоресценцію, судили про кількість с-fos- та  Всl-2 - позитивних нейронів у зразку.

Отримані результати досліджень оброблялись статистичним методом досліджень з використанням t-критерію Ст’юдента. Всі розрахунки проводили за спеціально розробленими ліцензійними програмами на ПЕОМ.