Request a thesis ВИВЧЕННЯ ГЕПАТОЗАХИСНОЇ ДІЇ ПРЕПАРАТУ З ТРАВИ ГОРОХУ ПОСІВНОГО

Матеріали та методи. Піфламін містить комплекс біологічно активних речовин, основними з яких є поліфеноли (флавоноїди і гідроксикоричні кислоти), амінокислоти, олігосахариди, гетерополісахариди, макро- та мікроелементи.

Фармакологічні дослідження проведені на мишах та щурах, які були вирощені у віварії ЦНДЛ НФаУ та утримувались на стандартному раціоні у відповідності з санітарно-гігієнічними нормами (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2001).

Основним препаратом порівняння служив аналог піфламіну за гепатозахисною дією – вітчизняний рослинний поліфенольний гепатопротектор силібор, який широко використовується в медичній практиці. В дослідженнях, проведених в умовах in vivo, силібор вивчали в дозі ED₃₀ за гепатозахисною дією - 25 мг/кг (Дроговоз С.М. та ін., 1998).

На першому етапі досліджень вивчали антиоксидантну активність піфламіну. В системі in vitro визначали сумарну антиокисну активність за методом Клебанова Г.І. зі співавт. (1988). Для підтвердження даної активності в системі in vivo використовували модель гострого тетрахлорметанового гепатиту у мишей (Слышков В.В., 1992). Дослідження проводили у порівнянні з класичним антиоксидантом - вітаміном Е та силібором. Ефективні дози піфламіну за антиоксидантною активністю визначали інтегрально за позитивною динамікою показників: масового коефіцієнту печінки (МКП) (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2001), вмісту у гомогенаті печінки компоненту антиоксидантної системи (АОС) - відновленого глутатіону (GSH) (Beutler E.D. et al., 1963) і продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) - малонового діальдегіду (МДА) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г.,1977) і дієнових кон’югатів (ДК) (Стальная И.Д., 1977).

Для з¢ясування деяких сторін механізму антиоксидантної дії піфламіну досліджували його антирадикальну активність в модельних системах in vitro, які створюють умови для генерації гідроксильних радикалів (Halliwell B. et al., 1987) та супероксиданіонів (Misra H.P., Fridovich I., 1972), а також оцінювали комплексоутворюючі властивості препарату в умовах аскорбатіндукованого ПОЛ при різних концентраціях іонів заліза (II) - каталізаторів вільнорадикального окиснення (ВРО) (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

Мембраностабілізувальні властивості піфламіну оцінювали за його впливом на ступінь спонтанного гемолізу еритроцитів в умовах in vivo за Jager F.C. (Вороніна Л.М. зі співав., 1996) і на вміст мембранозв¢язаного ферменту цитохрому Р-450 при аскорбатзалежному ПОЛ мікросом печінки в системі in vitro (Omura T., Sato R., 1964). Дослідження мембранотропності піфламіну в умовах in vitro та сумарної антиоксидантної, антирадикальної, комплексоутворюючої активності виконані на базі БІН при Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна.

Дослідження протизапальних властивостей піфламіну проводили згідно з Методичними рекомендаціями (“Доклінічні дослідження лікарських засобів”, 2001) на моделях карагенінового, зімозанового набряків та декстранового запалення з використанням референс-препаратів: силібору, вольтарену, кверцетину, модельної речовини BW 755 С. Вплив піфламіну на судинно-тканинну проникність в осередку запалення визначали за методом Голікова П.П. (1964).

Вивчення гепатозахисних властивостей піфламіну при пероральному введенні в лікувально-профілактичному режимі проводили на моделях гострого, субхронічного і хронічного гепатиту, викликаних гепатотоксинами: тетрахлорметаном, парацетамолом, тетрацикліном та комбінацією тетрахлорметану з етанолом (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2001). Вказані моделі адекватні захворюванням печінки у людини.

Функціональний стан печінки і лікувальний ефект піфламіну на всіх відтворених моделях оцінювали за біохімічними показниками сироватки крові, гомогенату тканини печінки і жовчі, за МКП, а також за результатами гістоморфологічного аналізу структури печінки уніфікованими методами електронної (Гайдер Г., 1974) та світлової мікроскопії з напівкількісною оцінкою змін (Автандилов Г.Г., 1980, Волкова О.В., 1982).

Критерієм стану системи “ПОЛ/АОС” були рівень МДА, ДК і GSH, які визначали так, як наведено раніше, гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) - за методикою Гаврилова В.Б. зі співавт. (1983), а також активність супероксиддисмутази (СОД) за методом Брусова О.С. зі співавт. (1976) і каталази за методом Королюк М.А. зі співавт. (1988). Вказані показники визначали у сироватці крові і гомогенаті печінки. Енергозабезпеченість гепатоцитів оцінювали за рівнем глікогену у гомогенаті печінки, який визначали за методом Кемпа і Кітца (Прохорова М.И. и др., 1995). Зовнішньовидільну функцію печінки оцінювали за зміною інтенсивності жовчовиділення (“Доклінічні дослідження лікарських засобів” (методичні рекомендації), 2001), вмістом жовчних кислот і холестерину у жовчі за методом Мірошниченко В.П. зі співавт. (1978). Про поглинально-видільну функцію органу судили за тестом з бромсульфалеїном (БСФ) за Ізрайлет Л.І. зі співавт. (1976). У плазмі крові виявляли церулоплазмін модифікованим методом Равіна і фібриноген за гравіметричним методом Рутберга (Камышников В.С.,2000). У сироватці крові, використовуючи набори реактивів фірми «Lachema» (Чехія), визначали активність індикаторного ферменту холестазу - лужної фосфатази (ЛФ) за Бесеєм, Лоурі, Броком; маркерів цитолізу - аланін- та аспартатамінотрансферази (АлАТ, АсАТ) за методом Reitman S., Frankel S.A.; рівень загального білка – біуретовим методом; загальних ліпідів – за реакцією з сульфованіліновим реактивом; холестерину - за реакцією Лібермана-Бурхардта; концентрацію сечовини - за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом. Вміст фосфоліпідів досліджували ензиматичним методом за допомогою набору реактивів фірми “Sentinel CH“ (Італія).

Гостру токсичність піфламіну з розрахунком середньолетальних доз при пероральному і внутрішньоочеревинному введенні визначали за методами Пастушенко Т.В. зі співавт. (1975) і Літчфілда-Уілкоксона (Криштопенко С.В., Тихов М.С., 1997). Ступінь токсичності визначали за класифікацією Сидорова К.К. (1973).

Вивчення впливу піфламіну на рухову активність шлунково-кишкового тракту (ШКТ) проводили за методом Sticknay I.S. зі співавт. (1951), на стан слизової оболонки і секреторну функцію шлунка – за методом Андреєвої Н.І., Шар ової С.Д. (1978).

Обробку одержаних результатів проводили за допомогою методів математичної статистики (Иванов Ю.И., Погорелюк Р.Н.,1990)

Дослідження фармакодинаміки субстанції та таблеток піфламіну. У зв¢язку з тим, що основним завданням даної роботи було фармакологічне вивчення і впровадження в медичну практику нового рослинного гепатопротектора, доцільно було провести дослідження складових ефектів багатогранної гепатозахисної дії: антиоксидантного, мембрано- і судиностабілізувального, протизапального, які за даними літератури (Барабой В.А., 1984; Максютина Н.П. и др., 1985) притаманні поліфенольним сполукам, що входять до складу піфламіну.

В системі in vitro при моделюванні процесу перекисного окиснення жовточних ліпопротеїдів встановлена сумарна антиоксидантна активність піфламіну у широкому діапазоні концентрацій – 250-1250 мкг/мл і здатність в найбільшій з доз інгібувати процеси ВРО на рівні 50 %.

Доказове підтвердження антиоксидантної активності піфламіну проведене на моделі гострого гепатиту, викликаного введенням мишам активатора процесів ВРО і ПОЛ - мембранотропного токсину тетрахлорметану (CCL₄)(Скакун Н.П. и др.,1995). У наведених дослідах встановлені ефективні дози піфламіну за антиоксидантною активністю - 100 і 150 мг/кг. Вплив препарату в наведених дозах на значення МКП, показників інтенсивності ПОЛ і стану АОС виявився їх відновленням до вихідного рівня. За ефективністю піфламін був близьким до дії класичного антиоксиданта - вітаміна Е у дозі 50 мг/кг (Місюрьова С.В. із співав., 1999) і позитивно відрізнявся від силібору в дозі 25 мг/кг відновленням фонду GSH. Проведені дослідження обґрунтували доцільність використання доз 100 і 150 мг/кг у подальших дослідженнях фармакодинаміки препарату в умовах in vivo.

Вивчення складових механізму антиоксидантної дії піфламіну підтвердило її полікомпонентність, властиву поліфенольним сполукам (Барабой В.А., 1976), зокрема наявність прямої антирадикальної і комплексоутворюючої дії. Антирадикальні властивості відносно активних форм кисню визначені за здатністю піфламіну гальмувати руйнування дезоксирибози гідроксильними радикалами (ID₅₀= 400 мкг/мл) і процес окиснення адреналіну, який проходить за участю супероксиданіонів (максимальний ефект препарату спостерігався в концентрації 25 мкг/мл на рівні 29,5%). В умовах аскорбатзалежного ПОЛ піфламін у концентраціях 62,5 і 125 мкг/мл пригнічував ініціативні ланки ліпопероксидації внаслідок інактивації каталізаторів ВРО - іонів заліза (II). Силібор за даних умов не виявив комплексоутворюючої активності, у 1,5 рази поступався піфламіну за здатністю інгібувати гідроксильні радикали (ID₅₀ = 600 мкг/мл) і виявив антирадикальну активність по відношенню до супероксиданіонів тільки на рівні 18,7 % у концентрації 6 мкг/мл.

Антиоксидантні властивості піфламіну забезпечуються комплексом БАР гороху посівного. Фенольна структура його флавоноїдів та гідроксикоричних кислот надає препарату можливості взаємодіяти з вільними радикалами, утворювати комплекси з іонами металів, сприяти відновленню та поповненню компонентів АОС в умовах гіперліпопероксидації (Барабой В.А., 1984). Наявні амінокислоти (цистеїн, метионін, гистидін, аргинін) як ендогенні метаболіти з антиоксидантною активністю забезпечують білоксинтетичні процеси та додатково захищають мембрани від пошкоджень вільними радикалами (Голиков С.Н. и др., 1986).

Відображенням антиоксидантних властивостей піфламіну став його позитивний вплив на стабілізацію мембран. Препарат в концентраціях 125 і 250 мкг/мл запобігав пошкодженню мембранопов¢язаного ферменту – цитохрому Р-450 в системі in vitro та в дозі 150 мг/кг достовірно знижував ступінь спонтанного гемолізу еритроцитів in vivo. Застосування силібору в аналогічних умовах не призводило до достовірних змін виучуваних показників, що підтверджує перевагу піфламіну перед препаратом порівняння за антиоксидантними властивостями.

В патогенезі захворювань печінки важливе місце належить запальному процесу (Дроговоз С.М., Сальникова С.І., 1995), а з даних літератури (Барабой В.А., 1984; Robak Jadwiga et al., 1996) відомо, що рослинні поліфенольні сполуки здатні усувати ексудативний компонент запальної реакції. Цей ефект пов¢язаний як з їх мембраностабілізувальними та антиоксидантними властивостями, так і зі здатністю інгібувати циклооксигеназний, та ліпооксигеназний шляхи метаболізму арахідонової кислоти. Наші дослідження, проведені на моделях запалення з участю різних медіаторів, дозволили встановити для піфламіну в дозі 150 мг/кг наявність протизапальної дії і припустити її можливі механізми. Дані, отримані в експерименті при відтворенні карагенінового, зимозанового набряків у щурів та декстранового запаленні вуха у мишей, дозволяють стверджувати, що в основі механізму протизапальної дії препарату лежить інгібуючий вплив на утворення лейкотриєнів (ЛТ), кінінів та серотоніну та відсутній вплив на простагландини (ПГ) (Di Rosa M. et all, 1971). Піфламін поступався за виразністю дії препаратам порівняння – вольтарену, кверцетину, модельній речовині BW 755C, але виявив перевагу перед силібором за антиліпооксигеназною активністю і схожість з ним в динаміці антиексудативної активності на моделі карагенінового набряку.

Встановлений інгібуючий вплив піфламіну на ЛТ має практичний інтерес, бо може сприяти зниженню запального процесу при захворюваннях печінки (Павловский М.П. с соавт, 1994), а відсутність впливу на синтез ПГ є свідченням відсутності токсичної дії препарату в ефективній дозі 150 мг/кг на функцію печінки і здатності підтримувати її фізіологічні можливості (Яковлева Л.В., 1992).

Позитивним доповненням до механізму протизапальної активності виучуваного препарату став встановлений нами судиностабілізувальний ефект піфламіну в дозах 100 і 150 мг/кг, який виявився при підшкірному введенні щурам білка і ксилолу - факторів, що викликають підвищення проникності судин (Яковлєва Л.В., 1984). Ефект піфламіну обумовлений спроможністю поліфенолів ущільнювати тканинні і судинні мембрани і знижувати проникність судино-тканинних бар'єрів (Барабой В.А., 1984). Важливо, що піфламін стабілізує проникність судин при ксилоловому запаленні достовірно виразніше, ніж препарати порівняння - кверцетин в дозі 50 мг/кг і силібор в дозі 25 мг/кг.

Таким чином, вивчення фармакодинаміки піфламіну виявило залежність встановлених ефектів препарату від дози і дозволило визначити ефективну дозу – 150 мг/кг, в якій піфламін in vivo виявляє широкий спектр фармакологічної активності: антиоксидантну, протизапальну, мембрано- та судиностабілізувальну.

Сучасна концепція вільнорадикального пошкодження клітинних мембран як основного патогенетичного механізму при ураженнях печінки (Скакун Н.П. и др., 1995; Логинов А.С., Матюшин Б.Н., 1996), розвиток запалення і порушення проникності судин при цих захворюваннях (Яковлєва Л.В., 1984, Яковлєва Л.В., 1992) свідчать про практичну сторону отриманих результатів, які є підставою для вивчення піфламіну як гепатопротектора.

Поглиблене вивчення гепатопротекторної активності субстанції та таблеток піфламіну на моделях гострого та хронічного гепатитів у щурів. Широке застосування в гепатології препаратів, які містять поліфеноли і амінокислоти (Харченко Н.В, 2001), та наявність останніх у складі піфламіну обумовили вивчення гепатозахисного ефекту препарату у порівнянні з відомим рослинним поліфенольним гепатопротектором силібором.

Проведені дослідження на моделях гострих гепатитів у щурів (тетрахлорметанового (CCL₄-гепатит), парацетамолового – (ПЦГ), субхронічного тетрациклінового гепатиту (ТЦГ) і хронічного гепатиту, викликаного комбінованим уведенням CCL₄ і етанолу, визначили ефективну дозу піфламіну за гепатозахисною дією, яка склала 150 мг/кг.

Дослідження починали з моделювання гострого гепатиту у щурів введенням СCL₄, який у експериментальних тварин викликає морфологічні і біохімічні зміни близькі до гострих уражень печінки у людини (Губський Ю.І., 1989). Активація ПОЛ вільнорадикальними метаболітами цього гепатотоксина порушує обмін речовин і енергії, функції і структуру гепатоцитів і викликає солюбілізацію ферментів протоплазматичних, мікросомальних, лізосомальних, мітохондріальних та інших мембран та їх ушкодження. Результатом цих змін є жирова дистрофія печінки (Скакун Н.П. и др., 1995; ).

Свідченням вищенаведених порушень у наших дослідах (Рис.1) було накопичення в гомогенаті печінки продуктів ПОЛ - МДА і ДК, відповідно у 1,4 та 4,6 разів, зниження вмісту та активності компонентів АОС (GSH, СОД і каталази), підвищення в 1,9 рази у сироватці крові активності маркеру цитолізу гепатоцитів АлАТ, зниження в 1,7 рази жовчовиділення та у 2 рази - вмісту холатів у жовчі.

Піфламін за умов цієї патології проявив антиоксидантні властивості: достовірно (р£0,05) стримував накопичення МДА і знижував у 2 рази вміст ДК в печінці, нормалізовував рівень СОД і GSH. Позитивний вплив препарату на жовчоутворення пов’язаний з вираженими антиоксидантними властивостями препарату, зі спроможністю запобігати пошкодженню ферменту монооксигеназної системи цитохрому Р-450, нормалізувати енергетичні процеси. Відновлення функцій печінки відбувається також внаслідок стимуляції препаратом синтетичних процесів, що підтверджується даними електронної мікроскопії. Спостерігалась компенсаторна гіперплазія мембран гранулярної ендоплазматичної сітки, підвищення кількості рибосом та полісом, а також гранул глікогену. Зміни більшої частини зазначених показників піфламін корегував подібно до силібору, а його вплив на вміст МДА в печінці, інтенсивність жовчовиділення і концентрацію холестерину в жовчі був достовірно виразнішим (р£0,05), ніж у референс-препарата.