АНТИСТРЕСОВА АКТИВНІСТЬ БЛОКАТОРІВ РЕНІН - АНГІОТЕНЗИНОВОЇ СИСТЕМИ (Експериментальне дослідження)

summary

Методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на 450 білих нелінійних мишах масою 18-30 г і 460 статевозрілих щурах лінії WAG популяції Вістар обох статей з масою тіла 150-250 г. Утримання й використання тварин в ек-спериментах відбувалося відповідно вимогам “Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, що використовуються в дослідних і інших наукових цілях”(Strasburg, 18.03.1986 ).

Експериментальні тварини згідно умов дослідження, були поділені на групи по
6 голів в кожній. 1 група – інтактні щури, які утримувалися у вільній поведінці в умовах виварію та служили контролем. 2 група – тварини, яких піддавали дії го-строго ЕС. 3-5 групи щурів, у яких ЕС сполучався з введенням за 1-1,5 години до за-кінчення стресування одного з досліджуваних ІРАС. Щурам 6 групи вводили в аналогічних умовах дослідів препарат порівняння – феназепам.

У всіх серіях дослідів основні показники досліджувалися відразу після закінчення дії стресорного фактора.

При проведенні електрофізіологічних методів дослідження щурів наркотизува-ли нембуталом (15 мг/кг внутрішньоочеревно) (В.В.Мурашко, А.В.Струтинський, 1991). Евтаназія щурів здійснювалася шляхом одномоментної декапітації за умов, що відповідають   наказам МОЗ СРСР № 755 від 12.08.1977 р., МОЗ УССР № 32 від 22.02.1988 р. і вимогам “Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, використовуємих в дослідних і інших наукових цілях” (Strasburg, 18.03.1986).

Для моделювання ЕС використано реалістична модель нейрогенного стресу “Конфлікт аферентних подразнень” (Ф.П.Ведяєв, 1983) тривалістю 4 і 2 години  протягом  двох днів.

Із групи ІРАС досліджували 3 препарати: каптоприл (KRKA, Slovenia), еналаприл (HemofarmDD, Yugoslavia), які за механізмом фармакологічної дії відносяться до інгібіторів ангіотензин-перетворюючого ферменту (АПФ) і від-різняються між собою різною силою та тривалістю дії на підставі фармакокінетичних особливостей. Третім препаратом був лозартан (Merch C.O., USA), що інгібує РАС шляхом блокади АНТ-ІІ-рецепторів.

Дози, в яких вводили препарати,  вибрано  на підставі доз, апробованих  в   експериментальних  роботах і обгрунтованих в багатьох дослідженнях, як фармако-логічно ефективні (M.Bartosz et al.1997; A.Peсo-Antic et al.2000;  V.V.Petrov et al.2001; H.N. Chowta et al. 2002;): 5 мг/кг каптоприл і еналаприл; 10 мг/кг лозартан. Препаратом порівняння був відомий бензодіазепіновий транквілізатор з антистре-совими властивостями феназепам в дозі 2,5 мг/кг (Жердев В.П.  и др., 1987; Киричек Л.Т., 1990; Иноземцев А.Н. и др., 1996; Ерёменко А.В. и др., 1998).

Досліджувані ІРАС вводили внутрішьношлунково через зонд, одноразово на другий день моделювання ЕС за 1-2 години до закінчення стресування, що відпові-дає їх фармакокінетичним особливостям. Контрольні та стресовані тварини одержували дистильовану воду в аналогічних умовах.

Про стан ЦНС судили за величиною сумаційно-порогового показника (СПП) (С.В.Сперанский, 1965), поведінкою щурів у “відкритому полі” (Д.А.Кулагин, В.Н.Федоров, 1969), процесами навчання і відтворення навичок умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) (Л.А.Громов, П.И.Середа, 1992).

Вивчення впливу ІРАС на показники стану  ГГНС за умов ЕС проводилося шляхом визначення вагових коефіцієнтів лімфоїдних органів (тимус, селезінка), а також наднирників. Розрахунок коефіцієнтів маси органів проводили за спів-відношенням маси органу до маси тварини і виражали в %. Абсолютну кількість еозинофілів у крові визначали під мікроскопом шляхом підрахунку у камері Фукс-Розенталя при фарбуванні за І.С.Піралішвілі  (1968). Індекс Паулса у щурів розрахо-вували на підставі кількості щурів з виразками і середньої кількості виразок на одного щура (И.И.Брехман, О.И.Кирилов, 1966). Вміст вітаміну С в тканинах наднирників визначали за допомогою мікро-хімічного методу (R.W.Birch et al,
1933), рівень 11-ОКС в крові і в наднирниках  флюориметрично MPF-4 (P.De.Moor
et al., 1960).

Тканини   головного   мозку, селезінки, тимусу і правого наднирника фіксували в 10 %  нейтральному розчині формаліну, потім відмивали у спиртах зростаючої міцності, заливали в парафін  (Г.А.Меркулов, 1969).  Мікротомні  зрізи  товщиною 5-6 мкм фарбували гемотоксилином – еозином. Мікроскопічний аналіз проводили з використанням світлового мікроскопу “Olympus” (Японія),  цифрові зображення  мікропрепаратів наднирників піддавали морфометричному  дослідженню (ка-ріометрія) (К.Ташкэ, 1980). На тканині головного мозку проведено імунолю-мінісцентне визначення  молекул АНТ-І: за допомогою люмінісцентного мікроскопу “ЛЮМАМ И2”.

Про стан симпатико-адреналової регуляції судили за вмістом адреналіну (А) і норадреналіну (НА) в сироватці крові і в тканинах мозку, який визначали флюориметричним методом (А.М.Петрунькина, 1961), враховували їх спів-відношення. Про стан холінергічної медіації судили за активністю холінестерази (ХЕ), яка визначалася титрометрично в % розкладеного ацетилхоліну теж в сироватці  крові і в тканинах головного мозку (С.Р.Зубкова, Т.В.Правдич-Неминская, 1947).

Рівень систолічного АТ у щурів визначали на хвостовій артерії електро-п’єзографічним методом (М.С.Расин и др., 1971) до початку дослідів (вихідний фон)

і через 1-1,5 години після введення ІРАС, що співпадало з фармакокінетичними особливостями кожного з вивчених препаратів при введенні у шлунок.

Біоелектричну активність міокарда щурів реєстрували на електрокардіографі “Салют” у ІІ стандартному відведенні з використанням голчастих електродів,   при  швидкості стрічкопротягу 50 мм/с і величині імпульсу  10 мм = 1 мВ (В.В.Мурашко, А.В.Струтынский, 1991). На електрокардіограмі (ЕКГ) вираховували частоту сер-цевих скорочень (ЧСС), вольтаж зубців R і  Т, розташування сегменту S-T відносно ізоелектричної лінії.

Спектрофотометрично визначали вміст продуктів, які реагують з 2-тіо-барбітуровою кислотою (ТБК-АП) (Т.Н.Федорова и др., 1983) і дієнових кон’югатів

(ДК)  (Б.В.Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983) в сироватці крові і в тканинах головного мозку.

Показниками антиоксидантного захисту служила активність ферментів супероксиддисмутази (СОД) і каталази. Взаємовідношення показників ПОЛ і ан-тиоксидантної активності (АОА) відображає інтенсивність і хід патологічного про-цесу. Визначення активності СОД проводилося на спектрофотометрі “Specol-10” (И.С.Чевари и др., 1985 ). Активність каталази визначали теж спектрофотометрично (И.В.Королюк  и др.,1988).Всі показники ПОЛ (ТБК-АП, ДК) та АОА (СОД, ката-лаза) визначалися в сироватці крові та в тканині мозку (корі, стовбурі, гіпоталамусі).

Позитивний вплив досліджуваних ІРАС в умовах ЕС на фармакологічні, електрофізіологічні, біохімічні і патоморфологічні показники розцінювалися як прояв антистресової дії, вираженість якої визначали за методами Ю.І.Добрякова (1978), Л.Т.Киричок (1990), О.М.Важничої, Т.О.Дев’яткіної( 2001).

Для оцінки участі РАС в механізмі антистресової дії вивчено рівень АНТ-І в сироватці крові і в гомогенаті цілісного головного мозку, для чого було використано імуноферментний метод і стандартні набори реактивів фірми Peninsulla Laboratories (Каліфорнія) (T.Porstmann, S.Kiessing, 1992). Крім того, стандартні набори реактивів використано для імунолюмінісцентного визначення молекул АНТ-І.

Вивчали вплив каптоприлу, еналаприлу й лазортану на гостру токсичність центрального α₂–адреноміметика клофеліну,  β–адреноблокатора анаприліну, блока-тора кальцієвих каналів верапамілу та міотропного спазмолітика дибазолу. Досліди виконано на статевозрілих білих мишах обох статей лінії BALB/С за-гальноприйнятим методом вивчення гострої токсичності (М.Л.Беленький, 1963). У кожній з 4-х серій дослідів на мишах антигіпертензивні препарати вводили одноразово внутрішньоочереванно в наростаючих дозах від максимально переносимих до абсолютно смертельних через 1-2,5 години після одноразового введення у шлунок ІРАС відповідно до їх фармакокінетичних особливостей. Контрольні тварини одержували антигіпертензивні засоби без попереднього введення ІРАС. В цих умовах у тварин відмічали клінічні прояви гострого отруєння, кількість загиблих  тварин   від кожної дози препарату, ЛД₀, ЛД₁₀₀,  широту токсичної дії та термін загибелі. ЛД₅₀ обчислювали на підставі одержаної низки доз,

які викликали різний відсоток загибелі мишей (від 0 до 100 %) за методом Літчфілда й Уілкоксона в модифікації З.Рота (1963). Одержані ЛД₅₀ зіставляли з контролем,  оцінювали різницю (Н.В.Саноцкий, 1970), що давало  змогу судити про наявність або відсутність впливу ІРАС. За вижившими тваринами спостерігали протягом 14 днів, визначаючи їх вагу через кожні 7 днів.

       Аналогічні за метою досліди з гострої токсичності виконано також на білих ста-тевозрілих щурах лінії WAG популяції Вістар, але при цьому використано  експрес-метод (Deichmann et la Blanc, 1970).

Первинний цифровий матеріал оброблено за загальноприйнятим у медико-біо-логічних дослідженнях методом варіаційної статистики (М.Л.Беленький, 1963). Для оцінки вірогідності одержаних результатів (Р) використано критерії t Ст’юдента. Виявлені зміни   оцінювалися як статистично вірогідні при Р < 0,05. У залежності від постановки дослідів зіставлення дії препаратів проводили або з вихідним фоном, або з контролем, із ЕС, між собою, та з феназепамом. Оцінка участі РАС в механізмі антистресової дії проведена за допомогою кореляційного аналізу методом рангів (Ю.И.Тюрин  и др., 1998) при використанні комп’ютерної програми “Statgraphics” (5 версія), що дало змогу встановити ступінь щільності кореляційного зв’язку між рівнем АНТ-І крові та мозку й показниками функціональних систем.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Виходячи з того, що інгібітори ренін-ангіотензинової системи відомі, перш за все, як антигіпертензивні засоби, що здатні впливати на роботу серця, дослідження почали з вивчення  їх впливу на серцево-судинну систему інтактних та стресованих тварин. Результати цієї серії експериментів показали, що використана нами модель емоційного стресу  призводить до характерних порушень з боку серцево-судинної системи за гіперкінетичним типом  у вигляді підвищення артеріального тиску, прискорення частоти серцевих скорочень та зміщення у більшості тварин сегменту S-T на електрокардіограмі відносно ізоелектричної лінії. Досліджувані препарати в інтактних щурів проявляють гіпотензивну, а за умов емоційного стресу – анти-гіпертензивну дію. Більш ефективним механізмом являється інгібування ангіотензинперетворюючого ферменту, тому що каптоприл і, особливо, еналаприл знижують в однаковій мірі артеріальний тиск в обох постановках дослідів, у той час як лозартан впливає на рівень артеріального тиску тільки в умовах емоційного стресу.  Еналаприл, що відноситься до проліків, проявляє  сильнішу дію порівняно з каптоприлом. Усі три препарати перевищують вивчений ефект за умов емоційного стресу у феназепама, що також не викликає сумніву, тому що транквілізатори забезпечують зниження артеріального тиску тільки за рахунок   психо-седативного ефекту. За результатами цієї серії дослідів вивчені інгібітори ренін-ангіотензинової системи проявляють також кардіопротекторні властивості, стабілізуючи визначені показники електрокардіограми, що змінюються під впливом емоційного стресу.

З боку центральної нервової системи використана в роботі модель емоційного стресу у вигляді конфлікту аферентних подразнень викликає порушення з ознаками збудження. Про це свідчать зменшення сумаційно-порогового показнику, під-вищення горизонтальної пробіжки, зменшення уринації та тенденція до збільшення дефекації.  За цих умов порушується  мнестична діяльность – виникає виразна тенденція до скорочення латентного періоду рефлексу  й терміну його прояву, що суттєво зменшує відсоток тварин, яких навчили,  і  зменшується короткострокова пам’ять. Дані  патоморфологічних дослідженнь тканини головного мозку стресованих щурів, показали, що емоційний стрес, який викликає спазм артеріол мозку та його оболонок, призводить до виражених структурних змін гіпоксичного та

гіпонутритивного характеру.

На тлі цих змін вплив досліджуваних препаратів на центральну нервову
систему має захисний характер, який формується на підставі гальмування несприятливої дії емоційного стресу. Введення препаратів збільшує сумаційно-пороговий показник (каптоприл, лозартан), відновлює, в першу чергу, емоційні реакції (каптоприл, еналаприл, лозартан), послаблюючи рухомість (еналаприл) або наближуючи її до контрольного рівня (лозартан), і покращують мнестичну ді-яльність щурів, особливо процес формування та збереження пам’яті (каптоприл, лозартан).

Зіставлення дії препаратів за функціональними і патоморфологічними даними дозволяє припустити, що в основі їх центральної антистресової дії лежить спаз-молітичний судинорозширювальний ефект, який веде до покращення кровопос-тачання тканини мозку та захисту його функціонального стану від розвитку гіпоксії. Порівняльний аналіз центральної антистресової дії вивчених препаратів свідчить про найбільшу активність лозартану. Це, вочевидь, пов’язано з впливом препарату переважно на тканинну ренін-ангіотензинову систему через ангіотензинові ре-цептори головного мозку. У цих дослідах еналаприл проявляє  найменшу
активність, що може бути викликано особливостями його  фармакокінетики, і більше, ніж каптоприл, поступається дією феназепаму, а лозартан за більшістю показників дорівнює, а за патоморфологічними – навіть перевищує активність препарату порівняння.

При стресовій дії  факторів будь-якої природи гіпоталамо-гіпофізарно-наднир-никова система реагує завжди однозначно зменшенням коефіцієнтів маси тимусу, селезінки, гіпертрофією наднирникових залоз, еозинопенією й дистрофічними порушеннями в слизовій оболонці шлунка у вигляді крововиливів або виразок. Перелічені зміни інтегральних показників стану гіпоталамо-гіпофізарно-наднир-никової системи спостерігалися і в нашому дослідженні. Крім того, порушувалися спеціальні функціональні  та патоморфологічні  показники, які визначали для одержання більш конкретної інформації щодо стану наднирникових залоз, тимусу й селезінки. Встановлено, що за умов емоційного стресу функціональна активність наднирникових залоз підвищується. Про це свідчить їх  гіпертрофія, а також змен-шення в них рівня вітаміну С та підвищення 11-оксикортікостерону в наднирникових залозах й в плазмі крові. Патоморфологічні дані теж свідчать про підвищену активність наднирникових залоз і лімфоїдних органів. Звертає на себе увагу спазмований стан судин, у зв’язку з чим тимус, особливо в корковому шарі, практично позбавлений лімфоцитів, у селезінці  відбувається  редукція лімфоїдних фолікулів,  у наднирникових залозах  коркова зона виглядяє пригніченою, а інші зони, в тому числі й мозковий шар, накопичують холестерин або у нейро-ендокриноцитах – катехоламіни.

Досліджувані в цих умовах інгібітори ренін-ангіотензинової системи від-новлюють усі інтегральні показники стану  гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової

системи, особливо дистрофічні зміни у шлунку, зменшуючи  індекс Паулса до 0. Прогностичне значення цього показника підкреслював академік С.В.Анічков (1985), який вважав, що вираженість виразкового процесу у шлунку є кінцевим результатом стресу. Клітинний склад лімфоїдних органів покращується у зв’язку з вазо-дилятаторною дією інгібіторів ренін-ангіотензинової системи та відновленням кровопостачання й транспортної функції судин. Це призводить до міграції
тимоцитів з коркового до мозкового шару тимусу, що узгоджується з підвищенням його коефіцієнту маси. Також спостерігається  активація лімфоїдних фолікулів у селезінці, особливо біля центральних артерій з неушкодженою стінкою і часткове відновлення функцій наднирникових залоз, де нормалізується рівень вітаміну С, знижується в них і в плазмі крові рівень 11-оксикортікостерону. Однак зберігається гіпертрофія наднирникових залоз, вочевидь, за рахунок накопичених в них початкових продуктів синтезу кортикостероїдів та самих катехоламінів.

Зіставлення дії препаратів у цілому на гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникову систему дозволяє стверджувати про переважний вплив еналаприлу і каптоприлу, навіть порівняно з феназепамом, що свідчить про  домінування судинного механізму захисту.

Модулюючою ланкою стрес-стимульованої системи при емоційному стресі є вегетативна регуляція. Саме тому в цих умовах підвищується переважно симпатичний тонус у тварин, що  зазнали впливу емоційного стресу. Це проявилося  збільшенням норадреналіну і адреналіну в крові та в тканині головного мозку, співвідношення яких свідчить про перевагу гормонального компоненту симпато-адреналового впливу. Судячи по зниженню активності холінестерази в обоїх  тканинах, що досліджувалися, за умов емоційного стресу підвищується й холінергічний тонус, тобто кількість ацетілхоліну  теж збільшується, але в меншій мірі, відбиваючи тим самим порушення вегетативної рівноваги. Досліджені інгібітори ренін-ангіотензинової системи її вирівнюють, головним чином, за
рахунок захисту адренергічного тонусу (в більшій мірі відновлюється кількість нор-адреналіну в крові і в тканині головного мозку, ніж адреналіну). Досліджуваним препаратам притаманна і антихолінергічна активність, яка в наших дослідах виявляється підвищенням активності холінестерази і відповідно зменшенням кількості ацетілхоліну. Інгібітори ренін-ангіотензинової системи вирівнюють вегетативну регуляцію, порушену емоційним стресом, більш за рахунок симпато-адреналового тонусу і менше – за рахунок холінергічного. Різний ступінь одно-спрямованої дії інгібіторів ренін-ангіотензинової системи на головні компоненти вегетативної регуляції  забезпечує відновлення її рівноваги. При зіставленні дії пре-паратів між собою можна вважати, що ступінь їх захисного впливу щодо вегетативної регуляції  однакова й відповідає ефектам феназепаму.

Нормальний перебіг різних фізіологічних процесів в організмі залежить в значній мірі від постійного підтримання в ньому прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. Порушення цих процесів має універсальний характер, властивий будь-

якій патології, в тому числі й стресовій. Не випадково Г.Сельє називав продукти перекисного окислення ліпідів  “первинними медіаторами стресу” (1992).

В умовах емоційного стресу біоокислювальна рівновага між показниками перекисного окислення ліпідів і антиоксиданнтої системи порушується переважно за рахунок збільшення продуктів перекисного окислення ліпідів і менше у зв’язку з активацією антиоксидантних ферментів. Особливо велика розбіжність між кількістю

дієнових кон’югатів  і продуктів, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою з одного боку, та активністю супероксиддисмутази і каталази – з другого спосте-рігається в тканинах головного мозку, головним чином – в його корі, де вміст дієнових кон’югатів збільшується в 3,3, продуктів, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою,  – у 8 разів, а активність супероксиддисмутази і каталази – в 1,5 і в 4,4 рази відповідно.

За цих умов провідний напрямок захисної дії інгібіторів ренін-ангіотензинової системи  проявляється зменшенням продуктів перекисного окислення ліпідів та збереженням на рівні емоційного стресу або контролю активності антиоксидантних ферментів. У крові цей ефект виразно спостерігається в дослідах з лозартаном по відношенню до продуктів, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою, і супероксиддисмутази, що наближується  до дії феназепаму. У головному мозку, переважно в гіпоталамусі, вміст продуктів, які реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою, нормалізується під впливом лозартану так, як і при застосуванні феназепаму; активність антиоксидантних ферментів у цій структурі мозку зберігається на рівні емоційного стресу під впливом каптоприлу або на рівні контролю в дослідах з еналаприлом, лозартаном і феназепамом.

Визначення за середніми даними співвідношення між показниками
 перекисного окислення ліпідів і антиоксидантної системи  свідчить про те, що інгібітори ренін-ангіотензинової системи вирівнюють його в крові та в гіпоталамусі, ліквідуючи прояв оксидативного стресу. У корі головного мозку і в стовбурі його прояви частково  зберігаються.