ПОИСК СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА СРЕДИ АНТИОКСИДАНТОВ В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ТИАЗОЛИДИНА : ПОШУК ЗАСОБІВ ПРОФІЛАКТИКИ ІШЕМІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ СЕРЕД АНТИОКСИДАНТІВ В РЯДУ ПОХІДНИХ ТІАЗОЛІДИНУ

summary

Матеріали та методи дослідження. Досліди виконані на 920 статевозрілих безпородних щурах обох статей масою 160-220 г. В експерименті використовувалися тварини після проходження карантину в умовах віварію ЛугДМУ протягом 14 діб.

Дослідження проводили в лабораторії кафедри фармакології ЛугДМУ сертифікованої Державним фармакологічним центром (ДФЦ) МОЗ України (посвідчення № 41 від 30.05.2002р. та № 07 від 29.09.2005р.) в рамках норм біоетики (наказ ректора ЛугДМУ № 3 від 10.11.2005р.) згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).

Експериментальною моделлю гострої ішемії головного мозку служив патологічний процес, який розвивається у тварин з необоротньою одномоментною двобічною оклюзією загальних сонних артерій до місця її біфуркації на зовнішню та внутрішню гілки. Оперативне втручання проводили під натрій-тіопенталовим (70 мг/кг) наркозом.

Віртуальний скринінг проводили серед оригінальних сполук похідних тіазолідину* на основі комп'ютерної програми PASS C&T (Prediction of Activity Spectra for Substances: Complex&Training) та Log/ACDLabs для дослідження антиоксидантної, антирадикальної та протиішемічної активностей.

Вивчення антиоксидантної активності (АОА) сполук проводили на двох моделях ініціювання ВРО - при неферментативному ініціюванні ВРО та по інактивації супероксидрадикалу.

Неферментативне ініціювання ВРО моделювали в суспензії яєчних ліпопротеїнів шляхом додавання FeSO₄. Інтенсивність протікання процесів ВРО в модельній системі оцінювали за концентрацією продуктів ПОЛ, що реагують з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) з урахуванням коефіцієнта молярної екстинції (Ю.І. Губський і співав., 2002).

Індукцію супероксидрадикалу проводили шляхом аутоокиснення адреналіну в адренохром у лужному середовищі. АОА оцінювали за ступенем гальмування утворення адренохрому (Hara P. Misra, 1972). Досліджувані речовини додавали в систему до ініціювання ВРО в кількості кратній їх молекулярній масі.

В дослідах in vitro в якості препаратів порівняння застосовували класичні антиоксиданти, а саме: для водорозчинних сполук - кислоту аскорбінову, жиророзчинних - токоферолу ацетат (В.А.Барабой, Д.А.Сутковой, 1997).

В серії фармакологічного скринінгу потенційних церебропротекторів сполуки, що вивчалися, вводили з профілактичною метою внутрішньоочеревинно одноразово за 30 хвилин до початку моделювання цереброваскулярної патології в дозі 100 мг/кг. В якості референтних препаратів використовували кавінтон („Гедеон Ріхтер”, Угорщина) в дозі 5 мг/кг (А.А. Спасов и соавт., 2003) та пірацетам („Дарниця”, Україна) в дозі 250 мг/кг (О.Ю. Бибик, 2002) за 30 хвилин до початку оклюзії сонних артерій. Ефективність препаратів оцінювали в динаміці за виживанням тварин та термінами їх загибелі, а також за клінічними симптомами перебігу гострої ішемії головного мозку в щурів.

В окремій серії токсикометричних досліджень похідного тіазолідину (Les-13), як найефективнішого церебропротектора за результатами попередніх комплексних скринінгових досліджень, вивчали гостру токсичність згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001) з застосуванням пробіт-аналізу з подальшою лінеаризацією експериментальних даних методом найменших квадратів (В.Б. Прозоровский, 1962).

________

*) Висловлюємо щиру подяку професору Р.Б. Лесику за синтез похідних тіазолідину

При розробці дозового режиму Les-13 сполуку вводили внутрішньоочеревинно в дозах: 50, 100 та 150 мг/кг в різний час відносно моменту двобічного перетину загальних каротидних судин. Ефективність субстітуенту оцінювали за виживанням щурів (через 9, 22 та 36 годин з моменту перетину загальних сонних артерій). Математичну залежність протиішемічного ефекту Les-13 від доз визначали методом двофакторного експерименту (Е.Е. Рафаелес и соавт., 1971) за допомогою спеціально розробленої на кафедрі фармакології ЛугДМУ програми для Pentium 200 MMX в середовищі Turbo Pascal V. 7.0., а аналіз функції та розрахунок оптимальних доз проводили графічним способом з використанням стандартної програми Mach Engine V 2.001 (Д.С. Кравець, 1999)*.

В подальшому щурам дослідної групи Les-13 вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді 1% водного розчину в дозі 91,8 мг/кг за 138 хвилин до початку моделювання ішемічного інсульту головного мозку. Всі досліди проводили в динаміці: через 1, 6 та 24 години після двобічного перетину загальних сонних артерій. Біосубстратами для проведення досліджень слугували сироватка крові та кора головного мозку.

Гомогенати тканин мозку готували на охолодженому (4°С) ізотонічному розчині натрію хлориду.

Антирадикальну активність Les-13 на моделі гострої цереброваскулярної недостатності вивчали методом біохемілюмінісценції (БХЛ). Для оцінки здатності впливу сполуки на динаміку перекисних процесів у дослідах in vitro в якості субстрата використовували стерильний 10% розчин альбуміну. БХЛ індукували перекисом водню (В.Д. Лук’янчук та співав., 1997). Кінетику вільнорадикальних реакцій реєстрували на люмінометрі «EMILLITE-1105» австро-німецько-російського виробництва фірми „Біо-Хім-Мак”. Кінетику надслабкого світіння в дослідах in vitro і in vivo оцінювали за амплітудою швидкого спалаху (I₁), амплітудою повільного спалаху (I₂), константою швидкості змін інтенсивності світіння (К₁), часом індукції повільного спалаху (t), а також загальною світлосумою реакції (S).

Серед продуктів ліпопереокиснення досліджували концентрацію початкових – дієнових кон’югатів (ДК) (И.Д. Стальная, 1977) та ТБК-реактантів (И.Д. Стальная, Г.Г. Гаршвили, 1977).

При вивченні стану основних компонентів антиоксидантної системи захисту організму визначали активність супероксиддисмутази (СОД) (В.А. Костюк та співав., 1990), а також рівень глутатіону відновленого (J. Sedluck, H.Lindsay, et al., 1968) та сульфгідрильних груп (G.L. Ellman, 1959). Забезпеченість організму ендогенними антиоксидантами в умовах експерименту оцінювали за станом перекисної резистентності еритроцитів (О.Г. Архипова, 1988).

_________

*) Щиро вдячні доц. Д.С. Кравцю за надання консультативно-методичної допомоги

Визначення рівня аденілових нуклеотидів в еритроцитах проводили методом тонкошарової хроматографії на пластинах фірми „Merk”, Німеччина (Н.Б. Захарова, В.И. Рубин, 1980). На підставі отриманих даних розраховували показники, які характеризують стан енергетичного гомеостазу у вивчаємих умовах експерименту: енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), індекс фосфорилювання (ІФ) та порівняльний коефіцієнт (К_пор).

Активність ферментів енергетичного обміну в крові оцінювали за допомогою біохімічних наборів „Філісіт-Діагностика” для лактатдегідрогенази (Україна) та „PLIVA-Lachema”- креатинкінази (Чеська республіка).

Вплив церебропротектора на зв’язувальну здатність сироваткових білків в умовах гострої ішемії головного мозку визначали методом рівноважного діалізу (А.И. Луйк, В.Д. Лукьянчук, 1984). Кількісні параметри, які характеризують процес зворотнього зв’язування – константу асоціації (К_ас.) та число місць фіксації (N), розраховували за розробленою на кафедрі фармакології ЛугДМУ комп’ютерною програмою (В.Д. Лук’янчук та співавт, 2004).

Патоморфологічне дослідження кори головного мозку проводили з використанням загальновідомих методичних прийомів (Р. Ліллі, 1969).

Отримані дані оброблені статистично за допомогою критерію t Ст’юдента (Ю.І. Іванов, 1990), а також непараметричного критерію статистики – точного методу Фішера для чотирипільної таблиці (Е.В. Гублер, 1978).