ЗАНОЗИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В РАЗВИТИИ И ПРОГРЕССИРОВАНИИ ПОЗДНИХ ОСЛОЖНЕНИЙ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА. ВОЗМОЖНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ТЕРАПИИ

summary

Работа выполнена на базе кафедры госпитальной терапии Нижегородской государственной медицинской академии, нейроэндокринологического отделения, отделения функциональной диагностики, отделения лабораторной диагностики Нижегородской областной клинической больницы им. Н. А. Семашко (гл. врач – к.м.н. Р.М.Зайцев). Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Нижегородской государственной медицинской академии (протокол № 4 от 09.04.2004 г.)
Исследование процессов свободно-радикального окисления проводилось на базе кафедры биологии Нижегородской государственной медицинской академии (зав. кафедрой – д.б.н., профессор Щербатюк Т. Г.)
Инфракрасный спектроскопический анализ выполнялся на кафедре общей химии Нижегородской государственной медицинской академии (зав. кафедрой – д.х.н., профессор Гордецов А.С.)
Настоящее исследование основано на результатах наблюдений 276 пациентов, страдающих сахарным диабетом 2 типа (СД 2)
Диагноз СД 2 и степень компенсации углеводного обмена устанавливалась согласно рекомендациям ВОЗ (1999) и « Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом » (2002).
В работе использована классификация степеней тяжести сахарного диабета СД 2 типа и поздних осложнений сахарного диабета, согласно «Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом » (2002).
Для реализации поставленных задач работа осуществлялась в 4 этапа:
I-этап. Составление полной клинико-лабораторно - инструментальной характеристики больных СД типа 2 . Пациенты были разделены на 4 группы по степени компенсации углеводного обмена, длительности сахарного диабета 2 типа:
1 группа (n=64) – Компенсированный сахарный диабет, длительность заболевания менее 5 лет,
2 группа (n=48) – Компенсированный сахарный диабет, длительность заболевания более 5 лет,
3 группа(n=74) - Декомпенсированный сахарный диабет, длительность заболевания менее 5 лет
4 группа (n=90) - Декомпенсированный сахарный диабет, длительность заболевания более 5 лет
II - этап. Дополнительно к базисной терапии больным после 5- 7 дней нахождения в стационаре вводились антиоксидантные препараты:
А.альфа-липоевая кислота (n= 55)
Б. мексидол (n=84)
В. альфа-липоевая кислота и мексидол одновременно (n= 24)
Г. дибикор (n=20)
Д. мексидол в дозе 100 мг (n=12)
Е. плацебо ( n=10)
До и после лечения проводился клинико- лабораторно- инструментальный контроль.
III этап. Оценка отдалённых результатов лечения через 1 год у пациентов, получавших антиоксидантную терапию препаратами альфа-липоевой кислоты, мексидолом, комбинацией этих препаратов.
IV этап. Пятилетняя оценка отдалённых результатов в группах пациентов, получавших терапию препаратами альфа-липоевой кислоты, мексидолом, комбинацией этих двух препаратов.
Группу сравнения составили 20 пациентов, которые не получали указанной антиоксидантной терапии. Для получения параметров нормы группу контроля составили 22 пациента, не имеющие сахарного диабета, не отличающиеся от групп наблюдения по возрасту и полу.
Методика применения препаратов в условиях стационара проводилась следующим образом. Препарат альфа-липоевой кислоты [(Тиоктацид ( Щварц Фарма, Германия), Берлитион ( Берлин Хеми), Тиогамма ( Вёрваг Фарма )] вводился ежедневно в дозе 600 мг в вену капельно на 200 мл физиологического раствора натрия хлорида в течениe 2-х недель. В дальнейшем пациентам было рекомендовано принимать препарат в таблетированной форме по 600 мг в сутки в течение 2 месяцев, 2 курса в год.
Препарат мексидол (Фармасофт, Россия) вводился ежедневно в дозе 200 мг в вену капельно на 200 мл физиологического раствора натрия хлорида в течение 2-х недель. При выписке пациентам было рекомендовано принимать препарат в таблетированной форме в дозе по 0,125 мг в сутки 3 раза в день в течение 2 месяцев. Курсы – 2 раза в год. Кроме того, 12-ти больным препарат мексидол вводился ежедневно в дозе 100 мг в вену капельно на 200 мл физиологического раствора натрия хлорида в течение 2-х недель.
Препарат альфа-липоевой кислоты (Тиоктацид, Берлитион,Тиогамма) вводился ежедневно в дозе 600 мг в вену капельно на 200 мл физиологического раствора натрия хлорида в течении 2-х недель одновременно с препаратом мексидол в дозе 200 мг в вену капельно на 200 мл физиологического раствора натрия хлорида. В дальнейшем пациентам было рекомендовано принимать препарат альфа - липоевой кислоты в таблетированной форме по 600 мг в сутки и мексидол по 0,125 3 раза день в течение 2 месяцев, 2 курса к год.
Десяти пациентам, вошедшим в группу плацебо, в течение 2-недель вводили 200 мл физиологического раствора натрия хлорида внутривенно капельно.
Дибикор ( Пик Фарма, Россия) применялся по 1 г в сутки ( 0,250 мг по 2 таблетки 2 раза в сутки) в течении 2,5 месяцев. В дальнейшем пациентам было рекомендовано принимать препарат по 1,0 г в сутки в течение 2-х месяцев, 2 курса в год.
Всем пациентам проводилось стандартное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование. Клиническое обследование включало сбор жалоб, анамнеза заболевания, проведение объективного осмотра. Всем пациентам выполнены общий анализ крови, мочи, ЭКГ в 12 изменениях, проведён осмотр окулистом с для определения степени диабетической ретинопатии, неврологом для уточнения наличия диабетической полиневропатии и её выраженности.
У больных сахарным диабетом определяли:
- показатели углеводного и липидного обмена
- функциональные возможности инсулярного аппарата и чувствительность к инсулину
- выраженность окислительного стересса (молекулярные продукты перекисного окисления липидов, антиоксидантные ферменты и неферментативные антиоксиданты, окислительно-модифицированные белки)
- состояние тромбоцитарно-сосудистого и плазменного звеньев гемостаза,
- функциональное состояние эндотелия по уровню косвенных маркёров содержания оксида азота (NO) - нитритов и нитратов в сыворотке крови, наличию фактора фон Виллебранда, пробе с реактивной гиперемией
- маркёры воспаления (острофазовые белки), продукты переаминирования
( печёночные ферменты).
Кроме того, с помощью электрофизиологических методов исследования оценивали:
Выраженность дистальной периферической полиневропатии, нарушения вегетативной регуляции сердца, цереброваскулярной недостаточности, состояние периферического кровотока в нижних конечностях, структурно-функциональное состояние сердечной мышцы.

Уровень глюкозы определялся в капиллярной крови глюкозооксидазным методом на анализаторе « Биосен 5030», на глюкометрах « Акучек Актив», « Элите» натощак, через 2 часа после еды и выражался в ммоль/л.
Суточный мониторинг глюкозы выполнялся c помощью CGMS (Continuous Glucose Monitoring System)- системы, производимой компанией « Medtronic MiniMed( США)».
Гликозилированный гемоглобин HbA1c определялся на жидкостном хроматографе Bio-Rad со стандартными наборами (France).
Базальный уровень С- пептида и инсулина измерялся в плазме венозной крови, взятой утром натощак в иммуноферментной лаборатории НОКБ им. Н. А. Семашко на люминометре-фотометре LM01A (Чехословакия). Уровень С-пептида оценивали с помощью диагностических иммуноферментных тест-систем « Mercodia C-peptide ELISA specific».
Уровень инсулина определялся с помощью иммуноферментного анализа с использованием ИФА набора « INSULIN» (Diagnostic System Laboratories).
Функциональную активность β -клеток ( ФАБ) оценивали по формуле D.R.Matthews и соавт., 1985, где ФАБ= [ 20 х ИРИ ( мкЕД/мл) ] / [ гликемия натощак ( ммоль/л)-3,5]- (Matthews D.R., 1985).
Индекс инсулинорезистентности оценивали по Matthews D.., и соавт
[гликемия натощак( ммоль/л) х ИРИ ( мкЕД/ мл)]/ 22,5 (Matthews D.M., 1985).
Исследовался спектр жирных кислот в сыворотке крови с помощью газовой хроматографии. Общий анализ крови проводился на автоматическом анализаторе « ADVIA 60». Исследование липидного профиля, уровней аспартатаминотрасферазы (АСАТ), аланинаминотрансферазы (АЛАТ), мочевой кислоты, щелочной фосфатазы(ЩФ), глютатионтранспептидазы (ГТП) , фибриногена , церулоплазмина, гаптоглобина, С-реактивного белка оценивали проводили с помощью анализатора CONELAB 20 ( Finland)
Уровень микроальбуминурии определяли в суточной моче турбометрическим методом на автоматическом анализаторе « Chem Well» с использованием диагностического набора « Microalbumin», США. Норма- ниже 30 мг в сут.
Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов со статистической оценкой флуктуации светопропускания обогащённой тромбоцитами плазмы проводили по методике З. А. Габбасова и соавт., исследование индуцированной агрегации тромбоцитов проводили турбометрическим методом G. V.R.Bo
в модификации J.R.O' Brien на двухканальном лазерном анализаторе агрегации ( 230 LA, НПФ « Биола», РФ) с использованием в качестве индукторов динатриевой соли АДФ ( ООО « Технология-стандарт», РФ) в конечных концентрациях 0,5 х10-6 М, 2 х10-6 М, 5 х10-6 М. .Определялось содержание фактора фон Виллебранда на формалинизированных тромбоцитах. Проводилась комплексная оценка коагулограммы.
. Интенсивность (Imax), светосумма (S) и ОАА определялись методом индуцированной хемилюминесценции. Imax– максимальная интенсивность свечения, свидетельствуюшая о свободнорадикальноий активности, измеряемая в mV., S- светосумма в относительной степени отражает содержание радикалов, соответствующих обрыву цепи свободнорадикального окисления. Эта величина обратно пропорциональна антиоксидантной активности пробы. ОАА измерялась в относ.ед Молекулярные продукты ПОЛ плазмы крови (диеновые конъюгаты (ДК), триеновые конъюгаты (ТК), малоновый диальдегид ( МДА) определялись на аппарате Helios (Thermo Spectronic, USA). Измерялись в ед. опт.пл/ г ткани. Для определения окислительной модификации белков (ОМБ) был использован метод, предложенный Levine (1990) в модификации метода Е.Е. Дубининой (1995). Оценивали ОМБ по уровню карбонильных производных, выявляемых в реакции с 2,4 – динитрофенилгидразином: альдегид-динитрофенилгидразоны (АДФГ) и кетон-динитрофенилгидразоны (КДФГ) Спонтанную и металл-зависимуюиндуцированную (индуцированную) окислительную модификацию белков анализировали одновременно. Оптическая плотность образовавшихся соединений регистрировалась при длинах волн 270 и 363 нм, измерение проводилось в относ ед. Для расчёта применялся коэффициент молярной экстинкции 22х 10 -3 М-1 см-1.
Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) использовался метод, разработан Nishicimi (1972), в адаптации Дубининой Е. Е. и др. (1988). Для определения активности каталазы (КАТ) использовался метод, разработанный Aebi (1970), в адаптации Королюк и др. (1988), Чевари и др. (1991). Определение активности глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы проводили по методике А.Г. Гаврилова (1986). Активность выражали в ед. активности на мг гемоглобина в минуту (ед. акт./мг Hb мин)
Для определения оксида азота в плазме крови нами использована методика определения NO по восстановление нитрата до нитрита по реакции Грисса (Green L. S et al., 1982). Концентрация NO выражалась в мкг/мл.
В данной работе для оценки выраженности окислительного стресса был использован метод клиновидной дегидратации (Шабалин В. Н., Шатохина С. Н. 1996,1999) позволяющий оценить структурные изменения сыворотки крови и сделать выводы о процессах, протекающих во всём организме: Под микроскопом изучались микроструктуры (фации) высушенной в течение 24 часов сыворотки крови больных СД. Оценивали наличие патологических структур, характеризующих острые и хронические воспалительные процессы (языковые микроструктуры), процессы склерозирования (листовидные структуры), напряжённости адаптационных механизмов гомеостаза (трещины « закрутки»), а также морщины, конкреции, прозрачность и подложку (Шабалин В. Н., Шатохина С. Н., 1999, 2000,2001). Для характеристики выраженности патологических процессов использовалась бальная оценка от 1 до 3-х (Щербатюк Т.Г, 2008). Проводилось фотографирование фаций с помощью микроскопа Leica DMLS и CCD- камеры Digital KOCOM, соединённой с компьютером Pentium III .Использовали увеличения в 25 раз.
С целью разработки новых методов диагностики сахарного диабета и окислительного стресса нами был использован метод инфракрасной спектроскопии, разработанный проф. А. С. Гордецовым (Нижегородская медицинская академия). Метод официально рекомендован Минздравом ЗФ (04/2001) для дифференциальной диагностики различных заболеваний. Изучалась суспензия высушенной в течение 24 часов и размельчённой сыворотки больного. Исследования выполнялись на инфракрасных - спектрометрах «Specord 75 IR»(Carl Ceiss Jena) с фотометрической погрешностью 0,2%. Инфракрасный спектроскопический анализ выполнялся в области 1200-1000 см -1. Результаты обрабатывались с помощью уникальных авторских программ. Определялись высоты пиков поглощения на наиболее информативных частотах, которые впоследствии преобразовывались в координаты трёхмерного пространства. При проекции этих точек на переднюю зрительную поверхность получалась фигура в виде многогранника, которую называют «компьютерным образом болезни».
Компьютерный анализ вариабельности ритма сердца осуществлялся при помощи прибора и программы « Полиспектр» (« Нейрософт», РФ). Осуществлялась оценка статистических показателей временного анализа, рекомендованных Европейским обществом кардиологии и Североамериканского общества стимуляции и электрофизиологии (Heart rate variability.). Проводилось суточное ЭКГ – мониторирование с определением суточной вариабельности сердечного ритма (ВСР) с использованием системы холтеровского мониторирования « Астрокард» (Россия). Показатели ВСР оценивались во временных (SDNN- стандартное отклонение величин интервалов NN за весь рассматриваемый период, SDANN- стандартное отклонение величин усреднённых интервалов NN, полученных на все 5-ти минутные участки регистрации,SDNNi – среднее значение стандартных отклонений по всем 5-минутным участкам периода наблюдения, pNN50 – количество пар последовательных интервалов NN, различающееся более, чем на 50 миллисекунд, полученное за весь период записи ) – и частотных областях (TotP – полный спектр частот,ULF – ультранизкие частоты<0,003 Гц,VLF – очень низкие частоты от 0,15 до 0,04 Гц, LF – низкие частоты от 0,04 до 0,150 Гц, HF – высокие частоты от 0,150 до 0,400 Гц, L/H – коэффициент вагосимпатического баланса)
Исследование анатомических характеристик, контрактильной и насосной функции ЛЖ сердца оценивали с помощью эходопплерокардиографии (ЭХО-КГ) на аппарате « ALOKA SSD-4000 - ProSound» (Япония) ультразвуковым датчиком 3,5 МГц в М-модальном и двухмерном режимах в стандартных ЭхоКГ позициях. Систолическая функция левого желудочка оценивалась по фракции выброса (ФВ), фракционной сократимости (ФС). Для изучения диастолической дисфункции измерялись следующие скоростные и временные показатели:E- максимальная скорость раннего диастолического наполнения левого желудочка (м/с), А- максимальная скорость позднего диастолического наполнения ( м/c), Их отношение – E/А. Норма составляет 1,0 – 1,2. Оценивали DTe – время замедления раннего диастолического наполнения (мсек) и IVRT - время изоволюметрического расслабления (мсек)
Изучали гемодинамику в магистральных артериях головы, экстра – и интракраниальных отделах методом ультразвуковой допплерографии с помощью аппаратов « Ангиодин» и « Премьер» (фирма БИОСС, Москва, Россия)в волновом допплеровским режиме датчиком 4 МГц с использованием переднее – шейного доступа. Исследование проводилось после 5 – минутной адаптации обследуемого. Качественную оценку допплерограмм кровотока осуществляли визуально по характеру огибающей кривой и концентрации частот вблизи максимума. Количественный анализ спектра допплеровского сдвига часто проводили путём компьютерной обработки на экране ультразвуковой системы и с помощью расчёта характеристик сосудистого допплеровского исследования . ( Куликов В. П., 1997). К последним относились следующие параметры линейной скорости кровотока, определённые по огибающей кривой: S- максимальная ( пиковая) систолическая , M- средневзвешанная во времени линейная скорость кровотока, D- конечная ( пиковая ) диастолическая скорость кровотока, PI – пульсативный индекс Gosling - отношение между разностью систолической и диастолической скоростей (от пика до пика) и средней скоростью, RI – резистивный индекс или индекс циркуляторного сопротивления Pourcelot - отношение между разностью систолической и диастолической скоростей (от пика до пика) к систолической скорости, S/D – - отношение между максимальными значениями систолической и диастолической скоростей, характеризующее сосудистую эластичность SB- отношение между средней арифметической систолической скоростью ( частотой), замеренной на вершине систолического пика и максимальной систолической скоростью. Оценивали толщину интима - медиа (ТИМ). Кроме того, в работе нами был использован метод транскраниальной допплерографии (ТКДГ), проводился часовой мониторинг.
Оценка эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) проводилась с помощью механического теста (манжеточной пробы) – временной окклюзии сосуда с последующим измерением поток-зависимой реакцией его на ишемию. Использовали дуплексное сканирование плечевой артерии по методике D.Celermajer с соавт., 1992 (Кунцевич Г. И., 2006) на ультразвуковом сканере « ALOKA 4000» (Япония) c помощью ультразвукового линейного датчика частотой 7,5 МГц. В манжете создавали давление, превышающее систолическое артериальное давление в плечевой артерии на 50 мм. рт. ст. Компрессию сохраняли в течение 5 мин, затем проводили быструю декомпрессию. В ходе исследования диаметр плечевой артерии измеряли: в покое, через 4,5 мин после наложения манжеты на область плеча в пробе с реактивной ни гиперемией, через 30 с, 60 с, 90 с после декомпрессии. Усреднённую за цикл скорость кровотока оценивают в покое и сразу после декомпрессии. Измерение диаметра просвета артерии проводили с использованием двух точек: одной - на границе адвентиция-медиа передней стенки артерии, другой - на границе медиа-адвентиция задней стенки. Диаметром плечевой артерии считали среднюю величину, вычисленную по трём сердечным циклам. В ходе исследования диаметр плечевой артерии измеряли в покое (0), через 4.5 мин наложения манжеты, через 30 секунд, 60 секунд, 90 секунд после декомпрессии в миллиметрах (мм). Поток-зависимую дилатацию как характеристику эндотелий - зависимого ответа рассчитывали как отношение изменения диаметра плечевой артерии в течение реактивной гиперемии к диаметру артерии в покое, выраженному в процентах к исходному диаметру. За норму принимали значение, равное 10±3,3 % (Celermajer D.S. et al 1993).
Электронейромиография (ЭНМГ) осуществлялась на аппарате « MBN-нейромиограф» ( Россия) при помощи стимулирующего поверхностного пластинчатого электрода ( катод-дистально, анод-проксимально), а отведение -стандартным набором монополярных, пластинчатых электродов диаметром 5 мм. Исследовались моторные порции малоберцовых нервов с определением амплитуды М-ответа, латентности М-ответа, площади М-ответа, скорости распространения волны (СРВ)
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывались статистически общепринятыми методами статистики на компьютере IBM PC при помощи пакета прикладных программ для обработки медицинской и биологической информации « STATISTICA 6.0» (StatSoft,Inc.,США). Осуществлялось определение средней (М), стандартного отклонения (SD). Характер распределения определялся при помощи критериев Шапиро - Вилко и Колмогорова – Смирнова. Параметрические данные описывались в виде средней (М) и стандартного отклонения (SD)в формате М ± SD. Непараметрические данные описывались в виде медианы, нижнего квартиля (25 процентиль) и верхнего квартиля (75 процентиль) в формате (Мe [25p;75p]). При нормальном распределении переменных для определения различий между двумя зависимыми и независимыми группами использовался парный и непарный t-критерий Стьюдента, а при непараметрическом - критерий Вилкоксона и Манна-Уитни соответственно. В случае множественных сравнений проводили попарное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна Уитни, применяя поправку Бонферрони при оценке значения р. (пересчёт уровня значимости для множественных сравнений по формуле po/ n, где po- 0,005, а -n – часло парных сравнений. Для оценки статистической значимости наблюдаемых различий 3 связанных (зависимых) групп и более на разных этапах динамического наблюдения при распределении, отличном от нормального, использовался непараметрический метод Фридмана с вычислением коэффициента конкордации Кендалла.
Различие между долями оценивали при помощи критерия χ² в таблицах сопряжённости. Сравнение относительных частот внутри одной группы проводили с использованием двустороннего критерия статистической значимости. При описании связанных групп исследований до и после воздействия применялся МакНемара χ². Для анализа взаимосвязи двух признаков использовали корреляционный анализ по Пирсону (для параметрических критериев) и по Спирмену (для непараметрических критериев) с обязательным визуальным контролем диаграмм рассеяния. При изучении связи нескольких признаков применялась корреляционная матрица. Использовалась следующая классификация силы корреляции в зависимости от значения коэффициента корреляции r : при величине r _< 0,25- слабая корреляция, при 0,25_0,75- сильная корреляция. Корреляции считалась значимой при p<0,05. В ходе исследования проводили проверку статистических гипотез о равенстве коэффициентов корреляции, полученных в разных группах объектов исследования. Для отбора наиболее значимых независимых переменных при нормальном распределении признаков применяли метод множественной пошаговой линейной регрессии (Реброва О. Ю., 2006)