КОПТЕВ МИХАЙЛО МИКОЛАЙОВИЧ ТОПОГРАФІЯ ТА МОРФО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНИХ ЕЛЕМЕНТІВ ЛЕГЕНЬ У НОРМІ ТА ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ СТРЕСІ : КОПТЕВ МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ ТОПОГРАФИЯ И МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ЛЕГКИХ В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕСЕ

summary

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом дослідження були легені 60 білих щурів-самців лінії Вістар, з масою тіла 240–260 грамів, віком 8–10 місяців. Тварин утримували в стандартних умовах на звичайному раціоні віварію академії. Стать тварин дозволила виключити вплив статевих циклів на результати дослідження. Щури були розподілені на 3 групи, по 20 особин у кожній. Першу групу склали тварини для відтворення експериментальної моделі гострого іммобілізаційного стресу. Щури другої групи зазнавали впливу експериментального хронічного іммобілізаційного стресу. Третю, контрольну групу, склали інтактні тварини, які утримувались у стандартних умовах віварію і не були залученими до проведення жодних експериментів чи дослідів.
Експериментальна частина дисертаційної роботи виконана згідно з міжнародними нормами проведення біологічних досліджень, що засвідчено комісією з етичних питань та біоетики Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія» (м. Полтава) (наказ № 350 від 08.11.2012 р.). Дослідження відповідає вимогам «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, які використовуються в експерименті та інших наукових цілях» (Страсбург, 1985 р.), відповідного закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження» (№ 3 446-ІV від 21.02.2006 р., м. Київ), етичного кодексу лікаря України та етичного кодексу науковця.
За основу відтворення експериментальної моделі гострого іммобілізаційного стресу було обрано методику Ганса Сельє. З цією метою ненаркотизованих щурів іммобілізували у горизонтальному положенні на спині протягом 6 годин. Фіксація виконувалася за кінцівки, без ушкодження шкірних покривів та порушення гемоциркуляції. Експеримент проводився натщесерце з 9 до 15 години.
Для відтворення експериментальної моделі хронічного іммобілізаційного стресу щурів фіксували аналогічним способом щоденно, протягом 21 дня натщесерце. Фіксація тривала по 40 хвилин (з 9.00 до 9.40).
Забій тварин проводився на другу годину після завершення періоду фіксації шляхом декапітації під внутрішньоочеревинним наркозом з використанням тіопенталу натрію з розрахунку 50 мг/кг маси тіла. Після декапітації виконувалося розкриття грудної клітки, огляд її органів та органометричне дослідження легень. Поздовжній, поперечний та сагітальний розміри легень вимірювали за допомогою штангенциркуля ШЦ-1. Масу легень та їхніх часток визначали на вагах торсіонних WT-500.
Для проведення подальших макромікроскопічних досліджень, шматочки легеневої тканини, товщиною не більше ніж 0,5 см, фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну. Після фіксації матеріал промивали, зневоднювали шляхом відповідного проведення через спирти зростаючої концентрації, проводили через хлороформ та хлороформо-парафінову суміш і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 7–8 мкм готували на санному мікротомі. Мікропрепарати забарвлювали гематоксиліном та еозином, за Хартом-Ван Гізоном, за Маллорі і розміщували у канадському бальзамі під покривним склом. Забарвлення препаратів пікрофуксином за методом Ван Гізона використовували для виявлення колагенових волокон. Еластичні волокна забарвлювали за Хартом. Для виявлення відкладень фібрину в осередках крововиливів і набряку застосовували метод Маллорі (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971; Меркулов Г.А., 1969).
Для виготовлення напівтонких зрізів шматочки легеневої тканини занурювали у флакони з холодним 4% розчином глютарового альдегіду на фосфатному буфері з рН 7,4 і залишали у холодильнику. Через 1 годину попередньої фіксації, ці шматочки подрібнювали в краплі свіжого фіксатора на пластмасовій пластинці. Отримані тканинні блоки розміром близько 1 мм3 переносили у свіжий 4% розчин глютарового альдегіду з додаванням до нього 1% розчину хлористого кальцію. Потім ці блоки протягом 12 годин відмивали у кількох свіжих порціях 0,1М фосфатного буфера (рН 7,4) із додаванням хлористого кальцію. Упродовж наступних 2 годин отримані зразки фіксували в осмієвому фіксаторі. Після цього зразки протягом 1 години відмивали у буфері, проводили через спирти зростаючої концентрації і заливали в ЕПОН-812. Напівтонкі зрізи отримували за допомогою ультрамікротома УМТП-7. Перед забарвленням предметні скельця зі зрізами витримували протягом доби в термостаті при температурі (45–50)°С. Забарвлення отриманих зрізів проводилося 0,1% розчином толуїдинового синього на фосфатному буфері при рН 7,8 (Костиленко Ю.П., Ковалёв Е.В., 1978; Millonig G., 1962). Зрізи після забарвлення заключали в полістирол під покривні скельця і, після полімеризації, вивчали в світловому мікроскопі.
Вивчення отриманих зрізів проводилося за допомогою мікроскопа Biorex-3 BM-500T з цифровою фотонасадкою DCM 900 з адаптованими до даних досліджень програмами. Для отримання морфометричних показників використовували окуляр-мікрометр МОВ-16. Визначали наступні параметри: діаметр альвеол, товщину міжальвеолярних перегородок, товщину епітеліального шару слизової оболонки середніх та дрібних бронхів, діаметр просвіту артеріол, капілярів та венул.
Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали методом варіаційної статистики з використанням програми «Microsoft Excel» (2007). Для визначення рівня надійності результатів дослідження використовували параметричні методи аналізу. Для кількісних ознак, що відповідали нормальному закону розподілу, розраховували критерій Стьюдента-Фішера. Непараметричні методи використовували у випадку відмінності від нормального розподілу. Статистично вірогідними вважали відмінності p<0,05.