Разработка, развитие и опыт применения системы оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения Тышко Надежда Валерьевна

brief description

Тышко Надежда Валерьевна. Разработка, развитие и опыт применения системы оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: диссертация ... доктора Медицинских наук: 14.02.01 / Тышко Надежда Валерьевна;[Место защиты: ФГБУН Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи], 2019.- 277 с.
Разработка, развитие и опыт применения системы оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения Тышко Надежда Валерьевна
ОГЛАВЛЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
доктор наук Тышко Надежда Валерьевна
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Генно-инженерно-модифицированные организмы растительного происхождения: технологии получения и их развитие, мировое производство, преимущества и возможные риски

2 Развитие подходов, используемых при оценке безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: мировой и отечественный опыт

3 Обоснование цели и выбора методов исследования

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4 Материал и методы исследования

4.1 Экспериментальные животные

4.2 Экспериментальные рационы

4.3 Дизайн экспериментов

4.4 Подготовка материала для исследований

4.5 Методы оценки репродуктивной функции и развития потомства

4.6 Гематологические, биохимические и морфологические методы исследования

4.7 Методы исследования апоптоза

4.8 Методы статистического анализа

5 Результаты собственных исследований и их обсуждение

5.1 Формирование базы данных физиологических значений показателей, определяемых при токсиколого-гигиенических исследованиях генно-инженерно-модифицированных организмов

растительного происхождения

5.2 Оптимизация состава экспериментальных рационов для крыс

5.2.1 Сравнительная характеристика влияния состава экспериментальных рационов на рост и развитие крыс

5.2.2 Характеристика влияния солей лития в составе экспериментальных рационов на рост, развитие и

генеративную функцию крыс

5.3 Изучение репродуктивной функции и развития потомства крыс

5.3.1 Изучение влияния фактора сезонности на функцию репродуктивной системы крыс, пренатальное и

постнатальное развитие потомства

5.3.2 Выявление наиболее чувствительных показателей репродуктивной функции крыс в условиях токсического воздействия

5.3.3 Изучение репродуктивной функции и развития потомства

в поколениях крыс

5.4 Разработка моделей снижения адаптационного потенциала

с использованием токсических и алиментарных факторов

5.4.1 Разработка модифицированного состава рационов

для снижения адаптационного потенциала крыс

5.4.2 Разработка модели снижения адаптационного

потенциала крыс в условиях интоксикации кадмием

5.4.3 Разработка модели снижения адаптационного потенциала крыс при изучении репродуктивной токсичности

в условиях интоксикации глифосатом

5.5 Изучение активности апоптоза при токсиколого-

гигиенических исследованиях

5.5.1 Изучение активности апоптоза в различных органах крыс

в онтогенезе

5.5.2 Изучение активности апоптоза в печени крыс

в условиях интоксикации кадмием и четыреххлористым

углеродом

5.6 Разработка системы оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения

5.6.1 Система оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного

происхождения с изменением одного признака

5.6.2 Система оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного

происхождения с комбинированными признаками

5.7 Использование новой системы для оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения

5.7.1 Результаты токсиколого-гигиенической оценки сои линий

FG72, MON87701, SYHT0H2, MON87708

5.7.1.1 Токсикологические исследования

5.7.1.2 Генотоксикологические исследования

5.7.1.3 Аллергологические исследования

5.7.2 Результаты токсиколого-гигиенической оценки кукурузы

линий 5307, M0N89034, 1507, MZHG0JG, DAS-40278-9

5.7.2.1 Токсикологические исследования

5.7.2.2 Генотоксикологические исследования

5.7.2.3 Аллергологические исследования

5.7.3 Результаты токсиколого-гигиенической оценки сои с

комбинированными признаками линии МОК87701*МОК89788

5.7.3.1 Токсикологические исследования

5.7.3.2 Генотоксикологические исследования

5.7.3.3 Аллергологические исследования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

bibliography

Генно-инженерно-модифицированные организмы растительного происхождения: технологии получения и их развитие, мировое производство, преимущества и возможные риски
Технологии генной инженерии, используемые при создании ГМ сельскохозяйственных культур с новыми свойствами, на сегодняшний день располагают значительным набором методов для осуществления переноса генов между таксономически разделенными растениями, расширяя возможности селекции практически безгранично. Вместе с тем, несмотря на сравнительно широкий выбор методов, для получения ГМ растений, предназначенных для промышленного использования, как и в конце 90-х начале 2000-х гг. в основном применяются агробактериальный и баллистический способы модификации растительного генома [84; 124; 248; 312].
Молекулярный механизм, с помощью которого бактериальный патоген Agrobacterium tumefaciens передает свою ДНК инфицированному растению, был открыт исследовательской группой под руководством Chilton M.D. в 1983 году [116; 239], именно это открытие легло в основу прорывной технологии генной инженерии растений агробактериальной трансформации. Ее использование для создания трансгенных культур позволило преодолеть межвидовые барьеры, ограничивающие возможности традиционной селекции, и значительно расширило перечень полезных признаков, которыми могут быть наделены хозяйственно-ценные растения [84; 312].
Баллистический способ трансформации генома растений (также называемый микробомбардировкой) основан на бомбардировке интактных растительных клеток золотыми или вольфрамовыми частицами размером 1,5-3,0 микрон, конъюгированными с рекомбинантной ДНК. Микрочастицы могут быть из любого химически инертного металла с высокой молекулярной массой (золото, вольфрам, палладий, родий, платина, индий и др.), чтобы не образовывать металоорганических комплексов с ДНК и обладать необходимой кинетической энергией для пенетрации клеточной стенки [57; 124; 239]. Посредством электрического разряда или декомпрессии частицам придается скорость 300-600 м/сек в направлении клеток-мишеней.
Первые прототипы ГМ растений, характеризовавшихся устойчивостью к пестицидам и насекомым, были разработаны более 30 лет назад [172; 205; 239], однако первой ГМ сельскохозяйственной культурой, официально разрешенной для использования в пищу в США, был томат сорта "FLAVR SAVR", характеризовавшийся пролонгированным сроком хранения. Тем не менее, наиболее популярными привнесенными признаками у ГМ растений, вышедших в коммерческое обращение с 1996 года по настоящее время, являются улучшенные агрономические характеристики, обеспечивающие устойчивость растений к пестицидам, вредителям, патогенам, намного реже встречаются растения с измененной пищевой ценностью, пролонгированным сроком хранения и устойчивостью к абиотическим стрессам [217; 289; 312; 329].
На пути масштабного прикладного использования современной биотехнологии встречаются определенные ограничения, которые можно разделить на объективные, обусловленные сложностью трансформации и регенерации некоторых видов растений, и субъективные, обусловленные неприятием обществом ГМ продукции. Одним из наиболее часто встречающихся опасений является использование "чужеродной" ДНК для трансформации генома растения-рецепиента [179; 257; 329; 377]. Как правило, в качестве доноров генов, отвечающих за проявление новых свойств у растений, используются повсеместно встречающиеся непатогенные микроорганизмы, не имеющие токсических или аллергенных свойств, однако аргументация противников трансгенеза инициировала развитие новой концепции генной инженерии, основанной на применении цисгенеза и интрагенеза. Цисгенез характеризуется использованием собственных генов растения или генов близкородственного вида, с которым возможно природное скрещивание, а также сохранением в исходной форме всех регуляторных элементов промотора, интронов, терминатора в "смысловой" ориентации; интрагенез характеризуется также использованием собственных генов или генов близкородственных видов, при этом гены и регуляторные элементы могут быть изменены методами генной инженерии. Следует отметить, что полученные подобным образом организмы не приобретают принципиально новых свойств, происходит лишь усиление или ослабление уже существующего признака [158; 222; 355; 291; 396; 397]. Тем не менее, этот подход весьма эффективен и благообразен с точки зрения биобезопасности и экологичности получаемого продукта, что очень важно для потребителей, озабоченных присутствием чужеродной ДНК, маркерных генов устойчивости к антибиотикам и фрагментов векторных конструкций [396; 397]. Первичная структура геномов ГМ растений, созданных методами цисгенеза и интрагенеза, максимально приближена к растениям, полученным посредством традиционной селекции, поскольку во всех случаях работа проводится с идентичным пулом генов.
С помощью цисгенеза и интрагенеза были получены: цисгенный картофель, устойчивый к инфицированию Phytophthora infestans [201]; устойчивые к болезням цисгенные яблоки [397] и виноград [137]; интрагенный картофель, характеризующийся снижением образования акриламида при термической обработке, что обеспечено замолканием клубнеспецифичных генов StAs1 и StAS2 биосинтеза аспарагина [339]. Группой исследователей под руководством Joshi S.G. [235] была изучена роль генов HcrVf1 и HcrVf2 при формировании устойчивости яблок к парше: были применены как цисгенный подход (регуляция экспрессии генов осуществлялась посредством оригинальных промоторов и терминаторов), так и интрагенный подход (в качестве регуляторов использованы элементы от яблочного гена рибулозобисфосфаткарбоксилазы) [239]. Идентификация генов и регуляторных генетических элементов, отвечающих за проявление искомых признаков, все еще является одной из самых актуальных проблем, сдерживающих развитие этого направления генной инженерии, однако достижения в области полногеномного секвенирования позволяют инвентаризовать геномы не только сельскохозяйственных растений, но и их диких родственников, обеспечивая расширение инструментария для манипуляций, в том числе, за счет выявления различных вариантов аллелей одного гена. Поскольку многообразие вариаций позволяет выбрать оптимальный по уровню экспрессии ген, технология цис- и интрагенеза в ближайшем будущем будет использоваться весьма широко, так как потенциал этого подхода будет расти с развитием научного знания о структуре и функции генов и регуляторных элементов [158; 300].
Ставшие уже традиционными агробактериальный и баллистический методы модификации растительного генома характеризуются сравнительно низкой эффективностью, отсутствием возможности задавать локус интеграции, предрасположенностью к множественным трансформациям, что потенциально может являться причиной как замолкания генов, так и формирования открытых рамок считывания, на основе которых впоследствии экспрессируются новые белки. Для компенсации всех вышеперечисленных недостатков и отбора оптимальных трансформационных событий используются комплексные молекулярно-биологические исследования, продолжительность и стоимость которых сопоставима или превышает затраты непосредственно на модификацию. Повышение эффективности и точности процесса модификации позволит сократить последующую стадию отбора, и именно в этом направлении велась интенсивная научная работа, одним из результатов которой является использование технологии сайт-специфической рекомбинации с помощью ферментов рекомбиназ [197; 101; 124; 403]. Функция рекомбиназ заключается в распознавании, связывании, вырезании и перестановке коротких последовательностей ДНК, длина которых может варьировать от 30 до 200 нуклеотидов. Сайты рекомбинации, как правило, состоят из двух связывающихся с рекомбиназой инвертированных повторов и расположенной между ними последовательности, внутри которой и происходит рекомбинация. Оба сайта рекомбинации, участвующие в процессе, в большинстве случаев идентичны, для таких систем достаточно только фермента рекомбиназы, однако, существуют и исключения: при участии неидентичных сайтов для рекомбинации требуется также участие дополнительных факторов, например, специфических белков, как при интеграции фага в геном E.coli. В настоящее время для трансформации растительных клеток принято использовать одну из трех систем сайт специфической рекомбинации: систему Cre-lox из бактериофага P1, систему FLP-FRT из S. cerevisiae, или систему R-RS из Zygosaccharomyces rouxi; в случае необходимости проведения рекомбинации между неидентичными сайтами применяются системы C31-att и -att.
Формирование базы данных физиологических значений показателей, определяемых при токсиколого-гигиенических исследованиях генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения
Как было отмечено в обзоре литературы, на стадиях создания и подготовки к выпуску на мировой продовольственный рынок новых ГМО проводятся всесторонние исследования, направленные на выявление у этих ГМО потенциальных негативных эффектов. За весь период промышленного использования ГМО, прошедших все этапы оценки, не было обнаружено их отрицательного влияния на здоровье животных или человека, что является дополнительным подтверждением как безопасности биотехнологической продукции, так и эффективности подходов, применяемых для оценки безопасности.
Тем не менее, исходя из возможности проявления неблагоприятных воздействий ГМО при длительном поступлении с пищей, их влияния на уровне эпигенома и метаболома, что, весьма вероятно, не вызовет существенного сдвига значений параметров, традиционно определяемых в токсиколого-гигиенических исследованиях, или напротив, неоднородного распределения значений некоторых показателей, затрудняющего интерпретацию результатов и обусловливающего ложное трактование данных в пользу признания опасности изучаемого ГМО, первостепенную важность приобретает установление границ нормы определяемых параметров. Принимая во внимание, что комплексные исследования включают изучение большого числа показателей, каждый из которых имеет широкий диапазон физиологических колебаний, объективизация и установление границ нормы для крыс, содержащихся в условиях вивария ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии", значительно облегчает интерпретацию получаемых результатов, особенно в условиях воздействий малой интенсивности [72].
Для определения диапазона физиологических колебаний, характерных для крыс линии Вистар, были обобщены данные, полученные от контрольных животных одного пола и возраста, использованных в токсиколого-гигиенических исследованиях ГМО. На основании статистической обработки разброса физиологических значений изученных показателей, была сформирована база данных, включающая параметры пренатального и постнатального развития потомства, массы внутренних органов плодов, самок и самцов, биохимические показатели сыворотки крови, активность ферментов антиоксидантной защиты и содержание продуктов перекисного окисления липидов в крови и печени крыс линии Вистар на разных этапах онтогенеза. Полученные результаты были использованы в качестве "интегрированного контроля" при анализе результатов более поздних исследований. Цифровые показатели пренатального развития, объединяющие такие параметры как количество желтых тел, количество мест имплантации, количество живых и мертвых плодов, а также расчетные показатели предымплантационной и постымплантационной гибели в норме варьируют в диапазоне значений, представленных в таблицах 23-27 и на рисунках 8-14.
В данном исследовании показано, что распределение признаков у показателей предымплантационной и постымплантационной гибели эмбрионов не отвечало требованиям нормального распределения (таблицы 24-27, рисунки 11-14), поэтому использование параметрических критериев M±m для описания этих показателей, применяемое повсеместно (таблица 28), характеризует ситуацию, по меньшей мере, необъективно. На основании анализа полученных данных мы предложили дополнять описание расчетных показателей гибели эмбрионов непараметрическими критериями, такими как медиана и процентильное распределение.
В целом полученные результаты согласуются с данными литературы (таблица 28), однако объем обработанных нами данных значительно превосходит все ранее опубликованные работы, что и определяет научную ценность данного исследования.
Зоометрические показатели плодов на 20-й день пренатального развития, включающие массу тела, кранио-каудальный размер, массу печени, почек, сердца и легких,обобщенные более чем от 1200 плодов, представлены в таблицах 29-30 и на рисунках 15-24.
Диапазон колебаний массы внутренних органов у беременных самок, а также у самцов 20-го, 60-го, 100-го, 150-го и 210-го дней жизни представлены в таблицах 33-44 и на рисунках 37-44.
Поскольку массу внутренних органов у самок измеряли на 20-й день беременности, расчет относительной массы внутренних органов (определяемой как отношение массы соответствующего органа на 100 г массы тела) не проводили. Принимая во внимание, что к концу беременности масса тела самки в среднем повышается на 30-40% и напрямую зависит от количества плодов, определение относительной массы, в обычных условиях предназначенное для нивелирования различий массы внутренних органов, обусловленных размерами животного, в случае с беременными самками нецелесообразно и напротив, будет способствовать бльшей вариабельности показателей.
Диапазон колебаний показателей антиоксидантного статуса крыс, включающих такие параметры, как активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, каталазы, а также содержание продуктов перекисного окисления липидов малонового диальдегида в эритроцитах, сыворотке крови и печени крыс на разных этапах онтогенеза представлены в таблицах 45-46.
Таким образом, на основании обобщения результатов исследования репродуктивной функции и развития потомства, зоометрических показателей (динамика массы тела и роста в 1-й месяц жизни, массы внутренних органов), показателей антиоксидантного статуса и биохимических показателей сыворотки крови у крыс контрольных групп, использованных в различных экспериментах, были получены интервалы нормальных значений (физиологических колебаний) для каждого из изученных показателей, которые были впоследствии использованы для анализа получаемых результатов.