Барт, Наталья Геннадьевна. Биотехнологические аспекты разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий рода Providencia

brief description

ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А.Столыпина»
04201355687
Барт Наталья Геннадьевна
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗРАБОТКИ ФАГОВОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ
БАКТЕРИЙ РОДА PROVIDENCIA

на правах рукописи

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология
диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Золотухин С.Н. доктор биологических наук, профессор Васильев Д.А.
Ульяновск - 2012
СОДЕРЖАНИЕ
Список условных сокращений......................................................................... 4
ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................... 5
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................... 12
1.1. История открытия и токсономическая характеристика
бактерий рода Providencia............................................................................. 12
1.2. Биологические свойства бактерий рода Providencia................................ 14
1.2.1. Морфология..................................................................................... 14
1.2.2. Культуральные свойства.................................................................. 14
1.2.3. Биохимические свойства.................................................................. 15
1.2.4. Антигенная структура и серологическая идентификация................. 17
1.2.5. Патогенность................................................................................... 18
1.2.6. Резервуар и распространение инфекционного агента....................... 20
1.2.7. Устойчивость к физико-химическим факторам................................ 24
1.3. Лабораторная идентификация бактерий рода Providencia....................... 25
1.4. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике....................... 29
1.4.1. Взаимодействие бактериофагов с клеткой-хозяином........................ 29
1.4.2. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование........................... 32
1.4.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).............................................. 37
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................... 43
2.1. Объект, материалы и методы.................................................................. 43
2.1.1. Материалы....................................................................................... 43
2.1.1. Методы............................................................................................ 47
2.2. Результаты собственных исследований................................................... 48
2.2.1. Выделение бактерий рода Providencia из объектов ветеринарного надзора и патологического материала....................................................................... 48
2.2.2. Выделение бактериофагов Providencia
и селекция клонов фагов........................................................................... 52
2.2.3. Характеристика фагов бактерий рода Providencia............................ 58
2.2.3.1. Морфология негативных колоний................................................. 58
2.2.3.2. Литическая активность бактериофагов Providencia....................... 60
2.2.3.3. Спектр литической активности бактериофагов Providencia........... 63
2.2.3.4. Специфичность действия бактериофагов рода Providencia......... 66
2.2.3.5. Температурная устойчивость бактериофагов
рода Providencia..................................................................................... 67
2.2.3.6. Устойчивость бактериофагов рода Providencia
к воздействию хлороформа.................................................................... 69
2.3. Разработка технологических параметров изготовления и контроля
индикаторных фагов Providencia............................................................ 70
2.4. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий рода
Providencia............................................................................................. 80
2.5. Разработка оптимальных условий постановки РНФ.................................. 85
2.5.1. Определение количественного показателя РНФ,
имеющего диагностическое значение........................................................ 85
2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями............................................................ 88
2.5.3. Разработка схемы постановки РНФ для индикации
бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора.................... 92
Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Providencia с помощью РНФ.................................................................. 92
Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Providencia с помощью РНФ....................................................................................... 94
Исследование фекалий, контаминированных бактериями
рода Providencia с помощью РНФ.......................................................... 95
Исследование мяса, контаминированного бактериями
рода Providencia с помощью РНФ.......................................................... 97
Исследование фекалий больных диареей телят на присутствие бактерий Providencia с использованием РНФ........................................................................... 99
Заключение................................................................................................... 107
Выводы......................................................................................................... 114
Практические предложения........................................................................... 115
Список использованных литературных источников...................................... 116

Приложения.................................................................................................. 140

bibliography

Выводы
1. В объектах ветеринарного надзора и патологическом материале Providencia обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно- кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолировано и идентифицировано 26 штаммов Providencia rettgeri.
2. Из 120 проб объектов внешней среды было выделено и селекционировано 14 бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Providencia.
3. Выделенные фаги имеют литическую активность от 10"5 до 10"10 по Аппельману и от 4,2 х 107 ± 0,1 х 107 до 8,3 х 109 ± 0,2 х 109 фаговых корпускул в 1 мл по Грациа. Установлено, что два бактериофага отличались широким диапазоном литической активности: F-87 УГСХА лизировал 82,1 % штаммов бактерий рода Providencia, F-67 УГСХА - 85,7 %, а в сумме фаги лизировали 96,4 % всех исследованных культур. Они обладали строгой специфичностью: не лизировали бактерии других родов и семейств.
4. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля бактериофагов Providencia позволяют получить специфический диагностический препарат штаммов F-87 УГСХА и F-67 УГСХА с высокой литической активностью. Разработанная схема с применением фагов F-87 УГСХА и F-67 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Providencia за 48 часов.
5. Штаммы фагов F-87 УГСХА и F-67 УГСХА были устойчивы к воздействию высокой температуры. Нижний порог термоинактивации составляет 67 °С, верхний - 88° С. Фаги не меняют литической активности при воздействии хлороформа в течение 40 минут.
6. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Providencia в объектах ветеринарного надзора и в патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (F-87 УГСХА и F-67 УГСХА), позволяют обнаружить бактерии рода Providencia в концентрации 103 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18-22 часа.