КУЗНЄЦОВА МАР’ЯНА ЮРІЇВНА. «МЕТАБОЛІЧНІ РЕАКЦІЇ ОРГАНІЗМУ ЗА ДІЇ ЕКСТРАКТУ ЛУШПИННЯ КВАСОЛІ ЗВИЧАЙНОЇ (PHASEOLUS VULGARIS) В УМОВАХ РОЗВИТКУ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ 1 ТИПУ»

brief description

КУЗНЄЦОВА МАР’ЯНА ЮРІЇВНА. Назва дисертаційної роботи: "«МЕТАБОЛІЧНІ РЕАКЦІЇ ОРГАНІЗМУ ЗА ДІЇ ЕКСТРАКТУ ЛУШПИННЯ КВАСОЛІ ЗВИЧАЙНОЇ (PHASEOLUS VULGARIS) В УМОВАХ РОЗВИТКУ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ 1 ТИПУ»"

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
На правах рукопису
КУЗНЄЦОВА МАР’ЯНА ЮРІЇВНА
УДК: 615.322: 616.379-008.64
«МЕТАБОЛІЧНІ РЕАКЦІЇ ОРГАНІЗМУ ЗА ДІЇ ЕКСТРАКТУ
ЛУШПИННЯ КВАСОЛІ ЗВИЧАЙНОЇ (PHASEOLUS VULGARIS) В
УМОВАХ РОЗВИТКУ ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ 1 ТИПУ»
03.00.04-біохімія
Дисертація
на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Науковий керівник
доктор біологічних наук,
старший науковий співробітник
Савчук Олексій Миколайович
Київ – 2016
2
ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ.................................................................... 6
ВСТУП ..................................................................................................................... 8
РОЗДІЛ 1. Патогенез розвитку цукрового діабету............................................ 13
1.1. Патогенез ушкодження панкреатичних β-клітин за умов цукрового
діабету ................................................................................................................. 13
1.2. Патогенез інсулінорезистентності за умов цукрового діабету............ 20
РОЗДІЛ 2. Фітозасоби у лікуванні цукрового діабету ...................................... 27
2.1. Фітозасоби, які виявляють свою антидіабетичну дію шляхом
нормалізації вторинних ускладнень цукрового діабету ................................ 28
2.2. Фітозасоби, які виявляють пряму антидіабетичну дію........................... 30
РОЗДІЛ 3. Матеріали та методи дослідження ................................................... 41
3.1. Реактиви та матеріали................................................................................. 41
3.2. Обладнання.................................................................................................. 42
3.3. Одержання водних екстрактів чорниці звичайної, суниці лісової,
кропиви дводомної, квасолі звичайної, розторопші плямистої та часнику
посівного ............................................................................................................. 43
3.4. Одержання сухого екстракту квасолі звичайної...................................... 43
3.5. Дотримання положень про гуманне відношення до тварин................... 44
3.6. Умови проведення досліджень на щурах ................................................. 44
3.7. Визначення толерантності до глюкози..................................................... 45
3.8. Визначення концентрації глюкози в крові щурів.................................... 45
3.9. Визначення токсичності екстракту квасолі звичайної............................ 45
3.10. Умови відтворення моделі цукрового діабету 1 типу........................... 46
3.11. Умови проведення експерименту для дослідження впливу екстракту
квасолі звичайної ............................................................................................... 47
3
3.12. Отримання сироватки крові щурів.......................................................... 47
3.13. Визнaчення біохiмiчних пoказників сироватки крoві щурiв................ 48
3.14. Визначення цитокінового профілю, вмісту інсуліну та імуноглобулінів
класу G у сироватці крові щурів....................................................................... 48
3.15. Визначення вмісту глікозильованого гемоглобіну у крові щурів ....... 49
3.16. Визначення засвоєння глюкози ізольованою гемідіафрагмою щурів. 51
3.17. Отримання гомогенатів нирок, печінки та м’язової тканини .............. 52
3.18. Отримання грубої мембранної фракції клітин м’язової тканини ........ 53
3.19. Визначення вмісту глюкозного транспортера ГЛЮТ-4 та інсулінового
рецептора у м’язовій тканині щурів................................................................. 53
3.20. Визначення загальної тирозинпротеїнкіназної активності у м’язовій
тканині щурів...................................................................................................... 54
3.21. Визначення гeксокіназної активнoсті у печiнці та м’язовій ткaнинi
щурів.................................................................................................................... 55
3.22. Визначення глікогенсинтазної активності у печінці та м’язовій
тканині щурів...................................................................................................... 56
3.23. Визнaчення вмiсту мaлонoвого диaльдегiдy у печінці та нирках
щурів.................................................................................................................... 57
3.24. Визнaчeння вмiстy шифових oснов та дієнових кон’югатів у печінці та
нирках щурів....................................................................................................... 58
3.25. Визначення суперокcиддисмутазної активності у печінці та нирках
щурів.................................................................................................................... 59
3.26. Визначення каталазної активності у печінці та нирках щурів............. 60
3.27. Визначення глутатіонпероксидазної активності у печінці та нирках
щурів.................................................................................................................... 61
4
3.28. Визначення глутатіон-S-трансферазної активності у печінці та нирках
щурів.................................................................................................................... 62
3.29. Визначення глутатіонредуктазної активності у печінці та нирках
щурів.................................................................................................................... 63
3.30. Хроматографічне розділення екстракту квасолі звичайної.................. 64
3.31. Визначення концентрації білка ............................................................... 64
3.32. Статистична обробка отриманих результатів ........................................ 65
РОЗДІЛ 4. Результати та їх обговорення............................................................ 66
4.1. Гіпоглікемічні властивості деяких лікарських рослин, поширених на
території України, що використовуються в народній медицині для
лікування цукрового діабету............................................................................. 66
4.2. Гіпоглікемічні властивості екстракту Р. vulgaris за умов
експериментального цукрового діабету 1 типу у щурів ................................ 77
4.3. Антидіабетичні властивості екстракту Р. vulgaris за умов його
довготривалого введення .................................................................................. 82
4.3.1. Показники вуглеводного обміну у щурів з моделлю цукрового
діабету 1 типу на фоні введення екстракту P.vulgaris. ............................... 83
4.3.2. Вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів та активність
ферментів антиоксидантного захисту у печінці та нирках щурів
з моделлю цукрового діабету 1 типу на фоні введення екстракту
P. vulgaris. ........................................................................................................ 93
4.3.3. Рівень цитокінів та імуноглобулінів класу G у сироватці крові
щурів з моделлю цукрового діабету 1 типу на фоні введення екстракту
P.vulgaris. ....................................................................................................... 104
4.3.4. Інсулінозалежні процеси внутрішньоклітинного метаболізму
глюкози у печінці та м’язовій тканині щурів з моделлю цукрового діабету
1 типу на фоні введення екстракту P. vulgaris........................................... 108
5
4.4. Дія екстракту P. vulgaris на засвоєння глюкози ізольованою
гемідіафрагмою та тирозинпротеїнкіназну активність in vitro ................... 119
4.5. Хроматографічне розділення екстракту P. vulgaris та дослідження
антигіперглікемічних властивостей його окремих фракцій........................ 122
ЗАКЛЮЧЕННЯ................................................................................................... 125
ВИСНОВКИ......................................................................................................... 132
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ........................................................... 134
6
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ
АЛТ  аланінамінотрансфераза
АСТ  аспартатамінотрансфераза
АОЗ  антиоксидантний захист
АФК  активні форми кисню
ВЖК  вільні жирні кислоти
ГГТ  гама-глутамілтрансфераза
ГК  гексокіназа
ГС  глікогенсинтаза
ГП  глутатіонпероксидаза
ГР  глутатіонредуктаза
ГТ  глутатіонтрансфераза
ДК  дієнові кон’югати
ІР  інсуліновий рецептор
ЛПВЩ  ліпопротеїди високої щільності
ЛПНЩ  ліпопротеїди низької щільності
МДА – малоновий діальдегід
ПОЛ – перокисне окиснення ліпідів
СОД – супероксиддисмутаза
СТЗ  стрептозотоцин
ТПК-аза  тирозинова протеїнкіназа
ЦД – цукровий діабет
ШО – шиффові основи
AMPK  AMP activated protein kinase (АМФ-активована
протеїнкіназа)
7
Аkt/РКВ  Аkt/protein kinase B (кіназа із серин-треоніновою
специфічністю)
nРКС  novel protein kinase C (нова серин-треонінова
протеїнкіназа С)
GLUT  glucose transporter (родина білків транспортерів глюкози)
IgG  immunoglobulin G (імуноглобуліни класу G)
IFN-γ  interferon-γ (інтерферон-γ)
IL  interleukin (інтерлейкін)
IRS 1-4  insulin receptor substrate proteins (білки субстрати
інсулінового рецептора
OPD  o-фенілендіамін
PDК1  3-phosphoinositide dependent protein kinase-1
(3-фосфоінозитидзалежна протеїнкіназа 1)
PEPCK  phosphoenolpiruvate carboxykinase
(фосфоенолпіруваткарбоксикіназа)
РІ3-кіназа  phosphatidylinositol 3-kinase (фосфатадилінозитол-3-кіназа)
TNF-α  tumor necrosis factor-α (фактор некрозу пухлин -α)
8
ВСТУП
Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) – це ендокринна патологія,
яка утримує стабільну першість серед захворювань, пов’язаних з
порушенням обміну речовин. Згідно з оцінкою експертів ВООЗ кількість
хворих на ЦД у 2014 році сягнула 422 мільйонів [1]. Понад 1 мільйон хворих
на це захворювання сьогодні зареєстровано в Україні і їх кількість постійно
зростає [2]. Пошук нових підходів у лікуванні ЦД становить актуальну
проблему медицини, що вказує на недостатню ефективність сучасних схем
лікування [1]. Саме тому на сьогоднішній день одним з напрямків біохімії
ЦД є дослідження антидіабетичних властивостей екстрактів рослин, що
обумовлено мультифакторним характером їх терапевтичного впливу на
перебіг ЦД, а також, на відміну від синтетичних лікарських препаратів та
практично відсутніми небажаними токсичними ефектами [3].
До перспективних джерел розробки антидіабетичних лікарських засобів
належить квасоля звичайна (Phaseolus vulgaris), відома у народній медицині
як ефективний гіпоглікемічний засіб. Показано гіпоглікемічну ефективність
екстрактів листя та бобів квасолі [3, 4]. Встановлено, що боби квасолі містять
інгібітори α-амілазної та глюкозидазної активності, які уповільнюють
засвоєння вуглеводів у шлунково-кишковому тракті [5]. Виявлено, що
екстракти бобів P. vulgaris мають протекторний ефект по відношенню до
інсулінопродукуючих β-клітин за умов ЦД [4]. Встановлено, що екстракти
листя P. vulgaris окрім вираженої гіпоглікемічної дії позитивно впливають на
функціональний стан печінки при ЦД [6]. Вітчизняними дослідниками
показано гіпоглікемічні властивості екстракту наземної частини P. vulgaris,
позитивний вплив екстракту на про/антиоксидантний баланс та вуглеводний
обмін у печінці за умов ЦД [7, 8].
До найбільш популярних народних засобів лікування ЦД серед
населення України належить відвар лушпиння бобів P. vulgaris. Однак,
9
антидіабетична дія цієї рослинної сировини залишається мало вивченою. У
науковій літературі зустрічаються поодинокі дослідження гіпоглікемічних
властивостей екстрактів лушпиння квасолі, зокрема щодо протекторного
впливу на стан печінки при ЦД [9]. Однак комплексні дослідження щодо
поліфункціонального впливу екстрактів лушпиння P. vulgaris за умов ЦД
відсутні. Більш того, лишаються мало вивченими механізми його впливу на
периферичні інсулінозалежні глюкозоутилізуючі тканини, зокрема, скелетні
м’язи, що засвоюють 85% глюкози у відповідь на стимуляцію інсуліном [10].
Тому проведення подібного дослідження може мати вагоме значення для
розробки нових лікарських засобів на основі екстракту лушпиння P. vulgaris.
Цим й зумовлена практична значимість роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу
виконано на кафедрі біохімії ННЦ «Інститут біології» Київського
національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науководослідної теми «Механізми реалізації адаптаційно-компенсоторних реакцій
організму за умов розвитку різних патологій» (2011-2016 рр., № д/р
0111U004648).
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було проаналізувати
метаболічні реакції організму за дії екстракту лушпиння квасолі звичайної
(Phaseolus vulgaris) на моделі цукрового діабету 1 типу.
Для досягнення мети було поставлено наступні завдання:
1. Порівняти антигіперглікемічну дію екстрактів рослин,
поширених на території України, які найчастіше використовуються при
терапії ЦД 1 типу та вибрати найефективнішу фітосировину.
2. Дослідити основні показники вуглеводного обміну у щурів з
моделлю ЦД 1 типу на фоні введення екстракту лушпиння P. vulgaris.
3. Вивчити показники інсулін-залежної ланки метаболізму глюкози
у печінці та м’язовій тканині щурів з моделлю ЦД 1 типу на фоні введення
екстракту лушпиння P. vulgaris.
10
4. Визначити вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів та
активність ферментів антиоксидантного захисту у печінці та нирках щурів з
моделлю ЦД 1 типу на фоні введення екстракту лушпиння P. vulgaris.
5. Дослідити вміст про- та протизапальних цитокінів та
імуноглобулінів класу G у щурів з моделлю ЦД 1 типу на фоні введення
екстракту лушпиння P. vulgaris.
Об’єкт дослідження: біохімічні механізми дії екстракту лушпиння
P. vulgaris за умов розвитку експериментального ЦД 1 типу.
Предмет дослідження: окремі показники вуглеводного обміну,
прооксидантно-антиоксидантної системи та імунологічного статусу у щурів
за умов експериментального ЦД 1 типу на фоні введення екстракту
лушпиння P. vulgaris.
Методи дослідження: центрифугування (ізолювання клітинних фракцій
та очищення сухого екстракту лушпиння P.vulgaris), спектрофотометричні
(визначення активності ферментів та вмісту продуктів пероксидного
окиснення ліпідів), імуноферментний аналіз (визначення вмісту інсуліну,
інсулінового рецептору, глюкозного транспортеру GLUT-4, цитокінів,
імуноглобулінів класу G та тирозинкіназної активності), хроматографія
(фракціонування сухого екстракту лушпиння P. vulgaris) та методи
математичної статистики.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджено
механізми антидіабетичної дії екстракту лушпиння квасолі звичайної
(Phaseolus vulgaris) у щурів за ЦД 1 типу. Встановлено, що довготривале
введення цього екстракту підвищує толерантність тканин до глюкози, а
також призводить до зниження концентрації глюкози, глікозильованого
гемоглобіну у крові щурів з ЦД 1 типу. Отримані результати свідчать, що
гіпоглікемічна дія екстракту не пов’язана зі зростанням концентрації інсуліну
у крові щурів за даних умов. Вперше показано, що за умов введення
екстракту лушпиння P. vulgaris щурам за ЦД 1 типу зростає рівень засвоєння
глюкози ізольованою гемідіафрагмою та зростає загальний вміст GLUT-4 у
11
м’язовій тканині. Виявлено підвищення глікогенсинтазної активності у
клітинах м’язової тканини та гексокіназної активності у клітинах печінки
діабетичних щурів, що може свідчити про можливий безпосередній вплив
фітокомпонентів P. vulgaris на перебіг інсулінозалежних процесів у клітинахмішенях гормону в рамках використаної моделі ЦД. Встановлено, що
регулярне введення екстракту лушпиння P. vulgaris протягом 28 діб щурам з
ЦД 1 типу, окрім поліпшення стану системи антиоксидантного захисту
(зменшення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів та
нормалізація ферментативної ланки системи антиоксидантного захисту)
виявляє також нормалізуючу дію на перебіг імунних процесів, дисбаланс
яких є невід’ємною патогенетичною ланкою запального процесу за умов
розвитку ЦД. Відповідно до аналізу основних біохімічних показників
сироватки крові, виявлено позитивний вплив екстракту на функціональний
стан печінки щурів за ЦД 1 типу. Виявлені зміни біохімічних параметрів
сироватки крові, які відображають стан ниркової функції, свідчать про вплив
даного екстракту на метаболічні функції цього органу.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено спосіб
отримання сухого екстракту лушпиння P. vulgaris. Встановлені
антидіабетичні властивості різної направленості сухого екстракту лушпиння
P. vulgaris (антиоксидантні, протизапальні, гіпоглікемічні) дозволяють
стверджувати про доцільність розробки фармацевтичного препарату на
основі даної сировини, що може бути використано для лікування ЦД 1 типу
та його ускладнень. Результати представленої роботи можуть бути
використані в ході навчального процесу для студентів біологічних
спеціальностей та студентів фармацевтичних та медичних навчальних
закладів при розробці лекційних курсів з вивчення механізмів дії біологічно
активних фітокомпонентів.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проаналізовано
наукову літературу за темою роботи, виконано експериментальні
дослідження та здійснено підготовку матеріалів до публікації. Здобувачем
12
підготовлено доповіді, які включали результати дослідженнь, написано та
подано до друку статті та тези в матеріалах конференцій та з’їздів. За участю
співавторів публікацій проведено інтерпретацію отриманих результатів.
Планування експерименту та розробка методичних підходів, формування ідеї
роботи, узагальнення результатів досліджень та редагування дисертаційної
роботи здійснено спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідались
на вітчизняних та міжнародних конференціях: ХІ Українському біохімічному
конгресі (Київ, 2014), Міжнародній науковій конференції «Механізми
функціонування фізіологічних систем» (Львів, 2014), IX Міжнародній
конференції молодих вчених «Біологія: від молекул до біосфери» (Харків,
2014), VІI Міжнародній науковій конференції «Психофізіологічні та
вісцеральні функції в нормі і патології» (Київ, 2014), XI Міжнародній
науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології»
(Львів, 2015), Міжнародній конференції для молодих учених «Сучасні
проблеми мікробіології та біотехнології» (Одеса, 2015), Науково-практичній
конференції «Мультипробіотики в профілактиці та лікуванні найбільш
поширених захворювань» (Київ, 2015), XII Міжнародній науковій
конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2016).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 наукових праць, у тому
числі 10 статей у фахових вітчизняних та міжнародних періодичних
виданнях, з яких 5 публікацій у виданнях, включених до міжнародних
наукометричних баз, 1 стаття у нефаховому виданні та 8 тез у матеріалах
з’їздів та конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу,
огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи та їх
обговорення, заключення, висновків та списку використаних літературних
джерел, що включає 241 найменування. Робота викладена на 160 сторінках
друкованого тексту, ілюстрована 6 таблицями та 28 рисунками

bibliography

ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі відповідно до поставленої мети проведено
комплексне дослідження біологічних ефектів сухого екстракту лушпиння
квасолі звичайної (Phaseolus vulgaris) та підтверджено його ефективну
антидіабетичну дію. Отримані результати обґрунтовують доцільність
використання даної фітосировини у медичній практиці для терапії цукрового
діабету та його ускладнень.
1. Встановлено, що екстракт лушпиння квасолі звичайної (Phaseolus
vulgaris) мав найвираженіший антигіперглікемічний ефект серед
досліджуваних представників вітчизняної флори. Отримано сухий екстракт
лушпиння квасолі звичайної та доведено його гіпоглікемічну дію за
концентрації 200 мг/кг маси тіла.
2. Застосування екстракту лушпиння квасолі звичайної за умов
цукрового діабету 1 типу призводило до зниження концентрації глюкози у
2,5 рази та рівня глікозильованого гемоглобіну на 20%. Не виключено, що
ефект екстракту не обумовлений його інсулінотропними властивостями.
3. Показано, що за умов введення екстракту лушпиння квасолі
звичайної щурам з моделлю цукрового діабету 1 типу рівень засвоєння
глюкози ізольованою гемідіафрагмою збільшувався на 80%, що може бути
обумовлено зростанням вмісту глюкозного транспортеру GLUT-4 на 45% в
м’язовій тканині. Виявлено, що введення екстракту лушпиння квасолі
звичайної позитивно впливало на процеси внутрішньоклітинного
метаболізму глюкози у печінці та м’язовій тканині щурів з моделлю
цукрового діабету 1 типу: зростала гексокіназна активність в печінці у 1,6
рази та глікогенсинтазна активність у м’язовій тканині у 2,5 рази. За умов
впливу екстракту не було встановлено змін вмісту інсулінового рецептора в
мембранній фракції кітин м’язової тканини, однак мав місце виражений
інгібуючий вплив екстракту на мембранозв’язану тирозинкіназну активність
133
клітин м’язової тканини як контрольних щурів у 2,2 рази так і тварин за ЦД у
1,2 рази.
4. Екстракт лушпиння квасолі звичайної нормалізував
прооксидантно-антиоксидантний баланс за умов цукрового діабету 1 типу.
Вміст продуктів ліпопероксидації МДА та ШО у печінці був знижений на 20
%, а ДК – на 30 %; у нирках вміст ДК і ШО був знижений на 30%, а МДА –
на 20 %, відповідно. Активність СОД та каталази була вищою у печінці у 2 та
1,8 рази; тоді як у нирках активність СОД була вищою у 1,8 рази, а каталази у
2,6 рази меншою за умов введення екстракту. Показано зростання активності
ГП та ГТ відповідно на 20 та 30 % у печінці; на 20 % та у 2 рази у нирках
щурів за ЦД 1 типу.
5. Екстракт лушпиння квасолі звичайної мав виражений
протизапальний ефект, про що свідчить зниження вмісту імуноглобулінів
класу G у 2,2 рази та зростання рівня протизапальних цитокінів ІЛ-4 та ІЛ-10
відповідно на 40 та 80 % у сироватці крові щурів за ЦД 1 типу.
6. Виявлено, що екстракт лушпиння квасолі звичайної проявляв
антидіабетичну дію, зокрема: позитивно впливав на динаміку зміни маси тіла
діабетичних щурів, нормалізував ключові біохімічні показники сироватки
крові (АЛТ, АСТ, ГГТ, холестеролу, ЛПВЩ). Встановлено посилення
споживання води щурами з ЦД 1 типу на фоні прийому екстракту, та
відхилення від норми таких сироваткових біохімічних показників як
креатинін та сечовина, що може свідчити про порушення функції нирок.