Подпалова Ольга Миколаївна Зміни скоротливої активності м’язів щурів за умов хронічної алкоголізації

brief description

Подпалова Ольга Миколаївна, асистент кафедри фундаментальної медицини ННЦ «Інститут біології та медицини» Київського національного університету імені Тараса Шевченко МОН України. Назва дисертації: «Зміни скоротливої активності м’язів щурів за умов хронічної алкоголізації». Шифр та назва спеціальності 03.00.02 біофізика. Спецрада Д26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Кваліфікаційна наукова
праця на правах рукопису
ПОДПАЛОВА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА
УДК:577.151.121:616.092.9
ДИСЕРТАЦІЯ
ЗМІНИ СКОРОТЛИВОЇ АКТИВНОСТІ М'ЯЗІВ ЩУРІВ
ЗА УМОВ ХРОНІЧНОЇ АЛКОГОЛІЗАЦІЇ
03.00.02 - біофізика
091 Біологія
Подається на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Дисертація містить результати власних досліджень. Використання ідей,
результатів і текстів інших авторів мають посилання на відповідне
джерело.
Підпис:
Науковий керівник: Нурищенко Наталія Євгенієвна, доктор біологічних
наук, старший науковий співробітник.
Київ-2021

ЗМІСТ
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
ВСТУП
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1.1.
1.2.
1.3.
Механізми впливу етанолу на біологічні об'єкти
Особливості структури 1 функціонування скелетних м'язів
1.2.1. М'язеві білки
1.2.1.1. Актинові філаменти
1.2.1.2. Структурно-функціональні властивості міозину
1.2.1.3. Дослідження взаємодії актоміозинового комплексу
1.2.2. Новітні теорії робочого циклу актоміозинового
комплексу. Регуляція скорочення 1 розслаблення м'язів
Механізми розвитку алкогольної міопатії скелетних м'язів
1.3.1. Молекулярні механізми розвитку міопатії в скелетних
м'язах, пов'язані з впливом на біосинтез білку
1.3.2. Механізми розвитку міопатії, пов'язані з впливом
алкоголю на вміст інтерлейкінів
1.3.3. Окисний стресс та мікроелементи при алкогольній
міопатії
1.3.4. Роль апоптозу в алкогольній міопатії
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
217.
Алкоголізація тварин. Відбір тварин до контрольних та
експериментальних груп
Визначення алкогольдегідрогеназної активності
Визначення креатинкіназної активності
Визначення вмісту ліпідів в плазмі крові та еритроцитарній масі
Визначення вмісту продуктів перекисного окиснення ліпідів
Виділення актоміозину із скелетних м'язів щура
Визначення концентрації актоміозину
10
12
13
18
18
26
28
28
30
33
39
43
45
47
49
50
53
53
54
55
56
57
58
59
2.8.
2.9.
2.10.
2.11.
Визначення АТФ-гідролазної активності актоміозину
Визначення вмісту карбонільних груп в актоміозині
Реєстрація динамічних параметрів при скороченні волокон
скелетного м'язу
Статистична обробка результатів
РОЗДІЛ 3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
3.1. | Алкогольдегідрогеназна активність в печінці щурів при
хронічній алкоголізації
3.2. Вплив хронічної алкоголізації на креатинкіназну активність
крові щурів
3.3. Вплив хронічної алкоголізації на показники перекисного
окиснення ліпідів у крові щурів
3.4. Вплив хронічної алкоголізації на АТФ-гідролазну активність
актоміозину скелетних м'язів щурів
3.5. Вплив хронічної алкоголізації щурів на ступінь окиснення
скоротливих білків скелетних м'язів
3.6. | Вплив хронічної алкоголізації на активність актоміозину
скелетних м'язів 50Пи5 щурів
3.7. Динаміка скорочення скелетних м'язів при хронічній
алкоголізації
ВИСНОВКИ
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
Додаток
11
60
62
63
70
71
71
72
75
79
84
88
93
133
135
158
ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ
2,4-ДНФГ - 2,4-динітрофенілгідразин
АДГ - алкогольдегідрогеназа
АЛДГ - альдегіддегідрогеназа
АДФ - аденозиндифосфорна кислота
АМ - актоміозин
АТФ - аденозинтрифосфорна кислота
АФК - активні форми кисню
ВММ - важкий мероміозин
ДСН - додецилсульфат натрію
ДТНЕБ - 5,5-дитіобіс-2-нітробензойна кислота
ЛММ - легкий мероміозин
МЕОС - мікросомальна етанол-окислювальна система
МКО - металкаталітичне окиснення
НАД - нікотінамідаденіндинуклеотид
ЦНЄ - центральна нервова система
ЗДТА - етилендиамінтетраацетат
НоО» - перекис водню
Ф, - фосфор неорганічний
ЕБКК - Кіпазе геєиіатеа Бу ехітасеПШиіаг 5ієпаїз
ПАЇВ - іегіеикіп-ІВ
Тт - торотуовіп
Тип - пторопіп
12
13
ВСТУП
Актуальність проблеми. Хронічне зловживання алкоголем може
призвести до цілого ряду ускладнень у скелетних м'язах, включаючи
хворобливість 1 атрофії з супутньою втратою м'язової маси, зміною ходи 1
порушенням рухливості. Ці розлади класифікуються як алкогольна міопатія й
супроводжуються важкими метаболічними, фізіологічними 1 структурними
змінами в скелетних м'язах |10, 33, 34.
Раніше вважалося, що скелетні м'язи є стійкими до дії ушкоджуючих
факторів, в тому числі етилового спирту 1 його метаболітів. Але згодом
з'ясувалося, що алкогольна міопатія спостерігається у хронічних алкоголіків
в 40 - 6090 випадків і зустрічається не менше як в 5 разів частіше ніж
алкогольний цироз печінки |36, 200). Хронічна алкогольна міопатія,
можливо, одна з найбільш поширених міопатій в Західній півкулі, і значно
більш поширена, ніж успадковані міопатії, такі як міопатія Беккера або
м'язова дистрофія Дюшенна. Але, як не парадоксально, викликані алкоголем
міопатичні захворювання є одними з найменш вивчених м'язових патологій.
В експериментальних роботах показано, що при хронічній алкогольній
міопатії переважно страждають волокна ПВ типу, тобто порушується
утворення найшвидших ізоформ скорочувального білка міозину |40,79, 82. У
той же час відомо, що в скелетних м'язах людини не містяться волокна ПВ
типу, а присутні швидкі гліколітичні волокна ПІОХ, містять інший ізомер
важких ланцюгів міозину.
Алкогольна міопатія вважається багатофакторною хворобою 1 тому
розуміння патогенезу цієї хвороби дещо ускладнене. Механізми, що ведуть
до розвитку патології м'язів при надмірному споживанні алкоголю мають
декілька варіантів реалізації.
Так, о розвиток алкогольної міопатії супроводжується зміною
окислювально-відновного статусу і антиоксидантним дисбалансом в
14
скелетних мязах |10, 31|. Є неспростовні докази того, що і хронічне вживання
алкоголю, і гостра алкогольна інтоксикація здатні погіршувати швидкість
білкового синтезу, в тому числі ії міофібрилярних білків, (12, 79, 187| та
синтезу ацетальдегід-білкових аддуктів |200|, порушеннями вуглеводного,
білкового та енергетичного обміну речовин, сигнальних каскадів, реалізації
апоптозу 1 регуляції генів (1831.
В цілому, більшість досліджень показують, що хронічна алкоголічна
міопатія помірно оборотня |37|, це залежить від дози алкоголю 1 тривалості
споживання. Наприклад, у 2004 були опубліковані дані, що показали, що
алкоголь-індукований дефіцит синтезу білка був нормалізований за наступні
72 години після відміни прийому алкоголю до відновлення факторів ініціації
та елонгації |209|. Проте результати деяких клінічних досліджень свідчать
про те, що м'язова слабкість 1 атрофія можуть тривати протягом багатьох
років, припускаючи, що довгострокове зловживання алкоголем може
призвести до незворотних змін (10).
Відомо, що природний стимулюючий сигнал, знаходячись у досить
вузьких межах частотних, амплітудних та часових характеристик в нормі,
широко варіює при відхиленні м'язу від фізіологічного стану |209|.
Очевидно, що зміна характеристик стимулюючого електричного сигналу
може вагомо впливати на загальний процес скорочення. Дане питання є
малодослідженим на сьогодні 1 потребує істотних практичних наробок.
Метою роботи було з'ясування впливу тривалої алкоголізації щурів на
функціонування скелетних м'язів за показниками динамічних параметрів
скорочення та змінами, що відбуваються в актоміозиновому комплексі, а
також виявлення показників, які б демонстрували наявність та вираженість
алкогольної деструкції.
Завдання:
1. За | показниками алкогольдегідрогеназної, креатинкіназної
активності довести наявність алкогольного ушкодження скелетних м'язів
щурів.
15
2. Дослідити | особливості | функціонування | актоміозинового
комплексу скелетних м'язів щурів через 2, 4, 6, 8 місяців алкоголізації.
3. Дослідити особливості динаміки скорочення скелетних м'язів у
хронічно алкоголізованих щурів в залежності від параметрів зовнішньої
стимуляції електричними імпульсами та тривалості релаксаційних періодів.
4. Проаналізувати криві скорочення на виявлення нелінійних
ділянок процесу.
5. В м'язах алкоголізованих щурів дослідити закономірності
наростання сили скорочення на дотетанічній та післятетанічній ділянках.
Об'єкт дослідження: механізм | м'язового скорочення при
алкоголізації.
Предмет дослідження: формування, виникнення та протікання
нелінійних процесів при скороченні скелетного м'язу алкоголізованого щура
в залежності від характеру частотно-модульованої стимуляції різної форми та
величини зовнішнього навантаження.
Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що
довготривалий вплив алкоголізації (до 8 місяців) має виражений вплив на
функціонування скелетних м'язів. Доведено, що патологічні зміни
відбуваються безпосередньо в скоротливому апараті, а не лише на рівні
нервової регуляції м'язового скорочення, чим пояснюється наявність тремору
у хронічних алкоголіків.
Показано, що АТФ-гідролазна активність в актоміозині скелетних
м'язів алкоголізованих щурів зменшується, що можна пояснити збільшенням
рівня його окисної модифікації. Дослідження динамічних показників
скорочення скелетних м'язів показали, що застосування модульованого
стимуляційного сигналу викликає значні флуктуаційні зміни та перехід м'язу
до стану регідності при тривалій стимуляції. При збільшенні часу релаксації
ці зміни зменшуються майже до показників контролю. Подальший аналіз
кривих скорочення показав, що на дотетанічних ділянках незалежно від часу
релаксації спостерігається збільшення часу наростання максимальної сили.
16
Таким чином, показник тривалості дотетанічної фази скорочення можна
використовувати для оцінки наявності та ступеня алкогольної деструкції.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть
бути корисними для діагностики та розробки клінічних методів
реабілітації при терапії та лікування розладів, пов'язаних із алкогольною
патологією, шляхом міографії.
Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно здійснював підбір
та аналіз наукового теоретичного матеріалу. Автором особисто здійснено
більшість експериментів, препарування м'язових об'єктів та реєстрацію
сили скорочення волокон м'язу під впливом частотно-модульованої
стимуляції, статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів
дослідження. Дисертант приймав активну участь у розробці концепції
роботи, обговоренні та формуванні зроблених висновків, що були
проведенно за участю наукового керівника.
Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були
представлені та обговорені: Междисциплинарная научная конференция
«Адаптационньюе стратеги живих систем» (Новьшй Свет, Крьюм, Украийна,
2012); ПіитасеЙишаг Зіспайпє апа Віоасйує Моіесиіев5 Девієп, 34 Пегпецопа!
Зутрозійт» (Іміу, ЮКгаїпе, 2012); П Наукова конференція молодих вчених
«Фізіологія: від молекул до організму». (Київ, Україна, 2012); МІ Пегпацопаї
зсіепийс сопіегепсе "РєуспорПпузвіоїоєусаї апа уїзсегаї Гипсйоп5 іп пог апа
рафоіоєву" (Куїу, ЮКгаїпе, 2012); Аппиа! Опаеготадиатеа Пегпацопа! 5срооі іп
Віотеадїса! 5сіепсе5 "Топ СПаппаїз іп НеаїШ апа Ріяеа8" (Київ, Україна, 2012);
П міжнародний семінар «Медична фізика - сучасний стан, проблеми, шляхи
розвитку. Новітні технології» (Київ, Україна. 2012); «МП з'їзд Українського
біофізичного товариства» | (Київ-Луцьк, 2019); «ТРре 6 їБ Іпіегпацопаї
Усіепійс апа Ргасіса! Сопіегепсе «СраПепее5 іп Усівєпсе ої Момадаузє»
(МУ азпіпеєюоп, Ю5А, 2020); Ргосеедіпє5 ої Фе бІП Пліегпайопа! Зсіепійс апа
Ргасіїса! Сопіегепсе Зсіепіїйс Богігоп іп Ше сопіехі ої 5осіаї стізе8, ТоКуо,
Їарап; Ргосеедіпєз ої Фе 6(П Плеглайопаї Усіепійс апа Ргасіса! Сопіегепсе
17
Усіепійс сопатипісу: іп(егдїзсіріпагу тезеагср. (Нагабигє, Сегтап, 2020);
Ргосеедіпяз5 ої (те біб Пліегпацопа! 5сіепийс апа Ргасиса! Сопіегепсе «Те 6 В
Пиеглацопаї 5сіепийс апа Ргасійса! Сопіегепсе «СраПепяе5 їп Зсіепсе ої
Момадауз» (М азпіпеіоп, О5А, 2020).
Публікації. За результатами роботи опубліковано 16 наукових праць,
в тому числі 10 статей у фахових виданнях з них І в науково-метричній базі
Зсори58, 6 тез доповідей і матеріалів всеукраїнських та міжнародних
конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 160
сторінках машинописного тексту 1 складається з анотації, вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів досліджень, розділу результатів досліджень
та їх обговорення, висновків та списку використаних літературних джерел Із
224 найменувань, ілюстрована 65 рисунками.

bibliography

ВИСНОВКИ
1. Хронічна алкоголізація щурів супроводжується ушкодженням
скелетних м'язів, про що свідчить підвищення креатинкіназної активності в
крові алкоголізованих щурів з подовженням строку споживання алкоголю.
При хронічній алкоголізації відбувається посилення процесів вільно
радикального окиснення, порушується функціонування актоміозинового
комплексу скелетних м'язів.
2. Порушення | функціональної | активності | актоміозинового
комплексу м'язів алкоголізованих щурів виражається у | зменшенні
показників Са""-МеУ-ДТФ-гідролазної активності актоміозину вже через 2
місяці та посиленні цих змін через 4, 6 та 8 місяців вживання алкоголю.
3. Порушення функціонування комплексу скоротливих білків при
алкоголізації | супроводжується | їх | окисною модифікацією, що
продемонстровано різким підвищенням рівня вмісту карбонільних груп через
6 місяців алкоголізації.
4. Довготривале вживання алкоголю викликає зміни показників
динамічних параметрів скорочення м'язів, що проявляються в зменшенні
м'язової потужності, зменшенні максимальних силових відповідей,
збільшенні часу досягнення стаціонарного стану, зменшенні зміни довжини
м'язу.
5. При недостатньому релаксаційному періоді м'язи
алкоголізованих тварин не здатні до фіксації стаціонарних ділянок
скорочення. Показано, що при тривалих скоротливих процесах з невеликим
релаксаційним / періодом - м'яз переходить в стан неконтрольованих
флуктуаційних скорочень на фазі утримання максимальних силових
відповідей. Наявність таких патологічних змін може призвести до
систематичних помилок точного позиціонування суглобів.
134
6. Патологічні прояви біомеханічних відповідей на стимуляційний
сигнал зменшуються із збільшенням часу релаксації. За умов релаксації не
менше 5 хвилин особливості відповіді м'язу з алкогольною патологією
зникають та наближаються до нормального фізіологічного рівня, що
ускладнює аналіз механізму алкогольної міопатії. Однак час досягнення
максимальної силової продуктивності скорочення лінійно збільшується при
наростанні додетатанічної фази 1 не залежить від тривалості релаксаційних
періодів. Цей показник можна розглядати як маркер розвитку патологічних
процесів в м'язі, пов'язаних з хронічною алкоголізацією.