Черненко Є.П. Бактеріальні хвороби томату і біологічне обгрунтування заходів обмеження їхнього розвитку

Краткое содержание

У вступній частині розкрито актуальність теми, сформульовано завдання, при вирішенні яких досягається мета досліджень. Обґрунтовано наукову новизну і практичне значення результатів роботи.

Огляд літератури

На підставі узагальнених даних літератури висвітлено історичний стан досліджень з поширення бактеріозів томату. Проаналізовано дані літератури щодо біологічних, морфологічних, фізіологічних, біохімічних властивостей фітопатогенних бактерій – збудників бактеріальних хвороб томату. Узагальнені дані стосовно стану вивчення можливості використання хімічних і біологічних препаратів у системі захисту томату від хвороб бактеріальної природи.

На основі аналізу сучасної української та іноземної літератури показано актуальність теми дисертаційної роботи та визначено доцільність проведених досліджень.

УМОВИ ТА МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дисертаційну роботу виконано в Національному університеті біоресурсів і природокористування України на кафедрі фітопатології ім. акад. В.Ф. Пере- сипкіна та у відділі фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Матеріали та об’єкти досліджень

Матеріалом для досліджень були зразки насіння та уражені рослини томату, які відібрані нами в різні фази розвитку з тепличних господарств Київської (Совки, Пуща-Водиця), Харківської (Інститут овочівництва та баштанництва (ІОБ УААН) і Херсонської областей, а також із Автономної Республіки Крим і дослідних полів Київської дослідної станції, ІОБ УААН Харківської області та дослідної польової ділянки ІМВ НАН України.

Об’єктом дослідження були ізольовані нами та отримані з колекції відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАНУ штами збудників бактеріальних захворювань томату:

·           бактеріального раку – Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith 1910) Davis et al. 1984 – 16 колекційних (10_{2 ,}13а, 14, 7741, 7744, 7748, 7905, 7934, 7960, 7961, 8240, 8504, Тл-3, Тк-5, Совки-1, Херсон) та 5 виділених нами (2п, 3, 3-1, 20, 64);

·           чорної бактеріальної плямистості – Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Doidge 1920) Dye 1978 – 14 колекційних (9, 7598, 7604, 7736, 7742, 7743, 7766, 7768, 7790, 7798, 7861, 7862, 8506, 8250) та 9 виділених нами (7, 17, 39, 41, 44, 48, 55, 66, 76);

·           бактеріального в’янення – Ralstonia solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al. 1996 – 2 колекційних (9049=УКМ В-1109^Т, 9081=УКМ В-1110) та 7 виділених нами (1-1, 1-2, 2-3, Re 2-3, 3-2, 4, 5-4);

·           крапчастості плодів – Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe 1933) Young et al. 1978 – 2 колекційних (8290, 140R=9167);

·           некрозу серцевини стебла – Pseudomonas corrugatа Roberts and Scarlett 1981 – 3 колекційних (9070, 9069, 9071);

·           бактерії-антагоністи – 2 колекційні відділу антибіотиків ІМВ НАНУ (УКМ В-5017, УКМ В-5137) та 10 виділених нами (Б-1, Б-2, Б-2(1), Б-3, Б-4, Б-5, Б-6, К-1, А, К).

Фітопатологічні та мікробіологічні методи аналізу уражених рослин та насіння томату

У виробничих умовах (поле, теплиця) візуально відзначали загальний стан росту рослин і типи захворювання за зовнішніми та внутрішніми (зрізи) ознаками (симптоми) наземних частин і коренів. Для лабораторного аналізу відбирали уражені рослини, групуючи їх за симптомами.

Пошук патогену проводили на межі ураженої та здорової тканин. Маленькі шматочки ураженої тканини після промивання, розтирали до гомогенного стану і висівали на пластинки картопляного агару (КА) в чашках Петрі. Кількість аналізованих зразків з кожного типу ураження становила 10. Сформовані колонії описували і відсівали на КА для подальшого вивчення їхніх патогенних та фенотипових ознак. Крім цього, насіння і шматочки уражених тканин розкладали на поверхні пластинок КА (метод обростання). Бактеріальну масу, яка виросла, аналізували (Бельтюкова та ін. 1968).

Енергію проростання та схожість насіння вивчали в чашках Петрі на фільтрувальному папері з ватною підложкою.

Патогенність виділених ізолятів в лабораторних і польових умовах визначали шляхом штучного зараження стебел, листків та плодів томату з 9-ї по 12-у годину методом уколу через краплю водної суспензії клітин бактерій з титром 1´10⁸ кл/мл або за допомогою Пастерівської піпетки. Як контроль використовували стерильну водогінну воду. Повторність дослідів 3–5 разова (Бельтюкова та ін. 1968).

Реакцію надчутливості (РН) листків тютюну вивчили шляхом ін’єкцій суспензій бактерій титром 10⁵ – 10⁷  під епідерміс (Klement et al. 1990).

Морфологію колоній описували на 3 – 4-ту добу за їхнього росту на КА. Морфологію вегетативних клітин та спор вивчали за допомогою світлового мікроскопа.

Нерозчинні у воді пігменти визначали за інтенсивністю кольору колоній, розчинні – за здатністю дифундувати до поживного середовища: м’ясопептонний бульйон (МПБ), желатин, молоко, Кінг Б та КА.

Установлення здатності засвоювати органічні сполуки як єдиного джерела вуглецю проводили на мінеральному середовищі Омелянського з водним індикатором – бромтимоловим синім (Бельтюкова та ін. 1968, Кучеренко 1967).

Здатність бактерій до росту в анаеробних умовах визначали у разі культивування їх на глюкозі під стерильним вазеліновим маслом.

Для виявлення протеолітичних ферментів використовували середовища з білком (желатин, знежирене молоко, МПБ). Протопектинази виявляли – розкладом шматочків картоплі; амілазу – за розщепленням крохмалю на КА. На МПБ відзначали здатність бактерій розщеплювати білок до індолу за Морелі та сірководню за Морісом. Редукцію нітратів до нітритів тестували за допомогою реактиву Грісса.

Спектр жирних кислот (ЖК) у клітинах досліджували за допомогою методу газорідинної хроматомас-спектроскопії. Для гідролізу бактеріальних клітин, їхніх ліпідів і метилювання ЖК бактеріальну масу витримували у 1,5 % -му розчині Н₂SO₄ в метанолі в запаяних ампулах протягом однієї години при температурі 80 °С. Метилові ефіри ЖК екстрагували двічі сумішшю діетиловий ефір – гексан (1:1). Підготовлені зразки аналізували в хроматомас-спектрометричній системі Agilent 6800N/5973 inert. Колонка HP-5МS (довжиною 30м та внутрішнім діаметром 0,25мм) з використанням нерухомої фази 5%-вого фенілметилполісилоксану товщиною 0,25 мм. Газ носій гелій (1 мл/хв), температура термостату 150 –250 °С, підвищення температури 4 °С на хвилину. Температура випарювача 250 °С. Детектор мас-спектрометричний, температура інтерфейсу 250 °С. Метилові ефіри ЖК ідентифікували за часом утримання їх порівняно зі стандартами. Як стандарти застосовували метилові ефіри ЖК фірми «Supelco». Вміст ЖК визначали за допомогою програмного забезпечення Agilent ChemStation.

Взаємовідношення між мікроорганізмами вивчали методом відстроченого антагонізму на КА (Егоров 1965).

Для виділення епіфітів насіння збовтували у стерильній водогінній воді, суспензію висівали на пластинки КА. Для виділення ендофітної мікрофлори поверхню насіння стерилізували 16,5 %-м розчином Н₂О₂, після чого його  розтирали і висівали на пластинки КА і інкубували 4 доби.

Чутливість фітопатогенних бактерій до пестицидів виявляли за інтенсивністю росту на КА з доданими до нього пестицидами в різних дозах.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

При обстеженні томатів у відкритому ґрунті виявлено домінування симптомів чорної бактеріальної плямистості, а у закритому – бактеріального раку та в’янення. У відкритому ґрунті найчастіше траплялися хворі рослини із симптомами, які найчіткіше виявлялись на листках і плодах. На листках спостерігали коричневі крапочки (1–2 мм), які були оточені хлоротичними ореолами. Одиничні крапочки зустрічались переважно на краю листкової пластинки та поблизу жилок. При масовому ураженні майже вся поверхня листка набувала хлоротичного забарвлення. Часом уражена площа збільшувалась, утворюючи великі плями (рис. 1а). Листки набували коричневого забарвлення, а згодом чорніли, засихали, але не опадали. Рослини поступово відмирали.